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猪细小病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与应用
摘 要 根椐GenBank 中等录的猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒2 型(PCV2) 病毒核苷酸序列,分别设计3 对引物,在建立各病毒单项PCR 技术的基础上,优化多重PCR 反应条件,建立了3 种病毒的多重PCR 检测方法,用这3 对引物对同一样品中的PPV、PRV、PCV2 核酸模板进行多重PCR 扩增,结果可同时扩增PPV 的475bp,PRV 的689bp,PCV2 的245bp 的特异性片段,而对其他4 种病原的PCR 扩增结果均为阴性.敏感性测定结果表明,该多重PCR 技术能检出10pg 的PPV、10pg 的PRV 和1pg 的PCV2 模板.用65 份临床病料对本研究多重PCR 技术和单项PCR 技术进行对比验证,结果显示：两者的总符合率为100%.表明建立的多重PCR 检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这三种病毒的同时检测、鉴别和诊断.
关键词 多重聚合酶链式反应；猪细小病毒；猪伪狂犬病毒；猪圆环病毒2 型
猪细小病毒(Porcine parvovirus,PPV)会导致感染母猪产出死胎、畸形胎、木乃伊胎及产出的仔猪病弱 [1].猪伪狂犬病毒(Porcine PseudorabiesVirus,PRV) 可导致妊娠母猪流产、死产、木乃伊胎,初生仔猪具有明显的神经症状,死亡率几乎100%[2].猪圆环病毒2 型(Porcine Circovirus2,PCV2) 与断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)、猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、仔猪先天性震颤等症状密切相关[3].因此,这三种病毒均是猪繁殖障碍类疾病的病原体,单纯根据临床症状不能鉴别诊断,且三者在临床上常呈混合感染.当同时感染两种或三种病原时,临床症状加重,将给养猪业造成巨大的经济损失[4,5].建立高效、快速、敏感的诊断方法对该3 种猪病的防控非常关键.针对这3 种病原传统检测方法耗时长、检测敏感性较低及准确性差等.PCR 检测方法以检测快度、灵敏度高、特异性好等特点已经广泛应用于多种疾病的检测,多重PCR 技术是在常规PCR 基础上发展起来的一种检测技术,在一个PCR反应体系中加入多对特异性引物,针对多个DNA 模板或同一模板的不同区域扩增多个目的片段的PCR 诊断技术,具有简便、快速、敏感、特异、易于操作和鉴别多种病原的等优点,即可以节约时间,又可以节省人力和物力[6],适合大量临床样品( 特别是混合感染样品) 中病原体的快速诊断.本文选择PPV VP2、PRVgD 和PCV2、ORF2 保守基因序列设计引物,优化了反应条件,建立一种可用于上述3 种病毒的多重PCR 诊断方法,并对临床病料进行检测.
1 材料与方法
1.1 病毒
猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2 型(PCV2)、猪瘟病毒(CV)、猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、流行性乙型脑炎病毒(JEV) 由山东省滨州畜牧兽医研究院预防兽医学与动物生物技术重点开放实验室提供.
1.2 工具酶及试剂盒
Taq DNA 聚合酶、M-MLV 反转录酶、RNasin、dNTPs、DL2000Marker 等试剂购自宝生物工程( 大连)有限公司,多功能DNA 纯化回收试剂盒、高纯质粒小量制备试剂盒购自北京百泰克生物科技有限公司产品,AxyPrep 体液病毒DNA/RNA 小量试剂盒购自爱思进生物技术( 杭州) 有限公司,其他化学试剂如氯仿、异丙醇、乙醇等,均为国产分析纯产品.
1.3 引物的设计与合成
参考GenBank 中登录的
PPV(JQ710901)、PRV(KF017337) 和PCV2(DQ104423) 基因序列, 利用Primer Premier5.0 软件设计3 对特异性引物,由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,用灭菌水溶解并配成15pmol/mL 溶液备用.
1.4 病毒基因组的提取
取感染PPV、PRV、PCV2 的细胞培养液,反复冻融3 次,经12,000rpm 离心20 min,取上清作为待测样品.按AxyPrep 体液病毒DNA/RNA小量试剂盒使用说明书分别提取提取PPV、PRV、PCV2 的DNA,并提取其他几种病毒的核酸.
1.5 反应条件优化
最适退火温度的确定：分别以50 ℃、52 ℃、54 ℃、56 ℃、58 ℃、60℃、62℃的退火温度进行梯度PCR反应,对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳观察,确定最佳退火温度.
最适引物浓度的确立：在25μLPCR 反应体系中分别以0.2pmol/μL、0.mol/μL、0.4pmol/μL、0.6pmol/μL、0.8pmol/μL 和1.0pmol/μL 的引物浓度进行PCR 扩增,产物进行琼脂糖凝胶电泳观察,确定最佳引物浓度,筛选出多重PCR 反应体系的最佳反应模式.
1.6 特异性试验
用已建立的多重PCR 扩增,分别对PPV、PRV、PCV2、CV、PRRSV、PEDV 和JEV 的模板进行扩增,扩增反应同时设双蒸水阴性对照,扩增反应结束后进行凝胶电泳检测,以检验多重PCR 的特异性.
1.7 多重PCR 的敏感性试验
分别提取PPV、PRV 和PCV2 的DNA,用仪器测定含量,并依次做10倍梯度稀释,每个稀释度取lμL 为模板,采用已优化的多重PCR 反应条件分别对上述不同稀释度的DNA 进行多重PCR 扩增,反应结束后进行凝胶电泳检测,以检测建立的多重PCR 的敏感性.
1.8 重复性试验
用建立的多重PCR 检测方法分别对PPV 感染的8 份阳性样品,PRV 感染6 份阳性样品,PCV2 感染的5 份阳性样品及5 份阴性样品重复检测3 次,以验证本方法的重复性和稳定性.
1.9 临床样品的检测
对山东、河南、江西、福建、四川和吉林等省65 份送检疑似病料进行多重PCR 检测.
2 结果与分析
2.1 反应条件的优化
通过对PPV、PRV 和PCV2 3 种引物浓度及多重PCR 扩增温度、时间和循环次数等的优化,最后确定多重PCR 中最佳引物浓度分别为PPV0.4pmol/μL、PRV 0.6pmol/μL、PCV2 0.6pmol/μL,多重PCR 的最佳反应模式为：94℃ 5 min,94℃ 45s,56℃ 45s,72℃ 45 s,30 个循环,最后 72℃ 延伸10 min.
2.2 扩增产物的检测
将PPV、PRV 和PCV2 的核酸分别进行多重PCR 扩增,结果能扩增出与预期相符,PCV2 的245bp,PPV 的475bp,PRV 的689bp 的特异性片段,而对照组扩增不出任何条带,其扩增产物的电泳结果见图1.
2.3 特异性试验
采用建立的多重PCR 方法对PPV、PRV、PCV2、CV、PRRSV、PEDV 和JEV 在相同的条件进行扩增.结果显示,PPV、PRV 和PCV2 的PCR 产物的片段长度分别为475bp、689bp 和245bp,与预期大小一致,而CV、PRRSV、PEDV 和JEV 均未扩增出片段,琼脂糖凝胶电泳结果见图2,说明本研究建立的多重PCR 方法特异性强.
2.4 敏感性试验
提取PPV、PRV、PCV2 基因组DNA,用仪器测定含量,然后做10倍梯度稀释,每个稀释度取1μL,作为模板.结果显示用10pg 的PPV、10pg 的PRV、1pg 的PCV2 可以扩增出特异性条带( 见图3).表明该多重PCR 敏感性强.
经过3 次重复操作,结果一致,表明本研究建立的多重PCR 方法是稳定可靠的.
2.6 临床样品的检测
对65 份在不同地区采集的疑似病料,用建立的多重PCR 和单项PCR进行了检测,两者符合率达100%( 见表2),结果表明建立的多重PCR 检测体系的特异性和敏感性较好.
3 讨论
在多重PCR 反应中,引物的设计很重要,对多重PCR 反应是否成功起着决定性的作用.
本研究分别针对PPV VP2、PRVgB 和PCV2 ORF2 保守基因序列设计引物,在这3 种病毒中,由于PPV 基因组序列的G+C 含量较低,而PRV属于疱疹病毒科,其G+C 含量较高,达73%,因此,在设计引物时,将扩增PCV2、PPV、PRV 这3 对引物的G+C 含量控制在45% ～ 60%,这样能确保所有的引物在相近的退火温度进行多重PCR 扩增,为成功进行多重PCR 反应奠定了基础.最后确定多重PCR 中最佳引物浓度分别为PPV、PRV 和PCV2 最佳引物浓度分别为0.4pmol/μL、0.6pmol/μL 和0.6pmol/μL.多重PCR 的最佳退火温度为56℃.该多重PCR 方法具有良好的特异性,对PPV、PRV 和PCV2 的扩增片段大小分别为475bp、689bp 和245bp,对CV、PRRSV、PEDV 和JEV 扩增结果均为阴性.该法敏感性高,对PPV、PRV 和PCV2 的最低检测量分别为10pg、10pg 和1pg.
4 结论
本研究用建立的多重PCR 方法对来自山东、河南、江西、福建、四川和吉林等省的65 份病料进行检测,同时进行单项PCR 检测,结果显示,多重PCR 方法与单项PCR 检测结果符合率为100%.共检出PPV 阳性样品8份,PRV 阳性样本22 份,PCV2 阳性样品14 份,二重混合感染阳性样品8份,三重混合感染阳性样品3 份.多重PCR 方法比单项PCR 检测方法可节省70% 的时间和2/3 的试剂用量,减少了污染环境的机会,对临床上猪细小病毒病、猪伪狂犬病毒病和猪圆环病毒病的检测具有较好的应用价值.
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