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穗花杉双黄酮对人胃癌细胞株MGC-803增殖抑制与凋亡的影响
【摘 要】目的：研究穗花杉双黄酮在体外对人胃癌细胞MGC-803 增殖抑制及凋亡的影响.方法：应用MTT 法检测穗花杉双黄酮对MGC-803 细胞增殖的影响；应用流式细胞仪检测穗花杉双黄酮对MGC-803 细胞凋亡的影响；应用Westernbolt 检测其对 MGC-803 细胞凋亡相关基因表达的影响.结果：穗花杉双黄酮在对MGC-803 细胞给药24 后,与空白组相比,能显著MGC-803 细胞的增殖,且这种抑制成浓度依赖关系.Annexin V/PI 双染法结果显示穗花杉双黄酮能诱导MGC-803 细胞的凋亡,且呈现浓度依赖关系,Western bolt 结果显示,穗花杉双黄酮能上调Bax 表达,下调Bcl-2 表达.结论：穗花杉双黄酮能有效抑制人胃癌细胞的增殖并诱导其凋亡；其机制可能是通过上调Bax 表达,下调Bcl-2 而实现.
【关键词】穗花杉双黄酮；MGC-803 胃癌细胞；增殖；凋亡
胃癌是常见的消化道肿瘤之一,其死亡率在所有恶性肿瘤位居前列[1].手术治疗是目前治疗胃癌的主要手段之一,配合化疗效果更佳,然而临床上目前常用的化疗药物具有较强的毒副作用,大多数患者身体状况已不能耐受化疗,因而越来越多的研究者讲研究重点放在从天然产物中寻找具有抑制肿瘤细胞的恶性增殖、诱导分化和促进凋亡的药物中.
石上柏又名卷柏、深绿卷柏、大叶菜等,具有清热解毒、抗癌止血的功效.主要成分为生物碱类、黄酮类、甾醇、皂苷、氨基酸等成分[2].药理活性研究发现其中一种黄酮类穗花杉双黄酮在体外有细胞毒活性,文献报道其有较强的抗肿瘤作用,为此,本文对穗花杉双黄酮作用于人胃癌细胞及其机制进行研究.
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 材料及试剂
穗花杉双黄酮购买自中国药品生物制品检定所,用DMSO 溶解,4℃保存,临用前用完全培养基稀释成所需浓度；1640培养基、小牛血清购买自美国Gibco 公司；四偶氮唑蓝(MTT) 试剂购自购买自Biosharp 公司；Annexin-V/PI 凋亡试剂盒购买自凯基公司,β-actin、Bax、Bcl-2 一抗购自美国santacruz 公司,山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗购买自北京中杉生物技术公司.
1.1.2 细胞株
人胃癌细胞株MGC-803 细胞购自中研所,用含10% 小牛血清以及1% 双抗的1640 培养液,在5%CO2 以及37℃环境下常规培养,取对数期生长期的细胞进行细胞实验.
1.2 实验方法
1.2.1 MTT 法检测穗花杉双黄酮对人胃癌细胞MGC-803 增殖的影响
取对数期生长的细胞作为实验细胞,接种于96 孔板,实验组加入含穗花杉双黄酮（浓度依次为400μmol/L,200μmol/L,100μmol/L,50μmol/L）的1640 培养液以及含DMSO 的1640 培养液（浓度为1‰）,设空白对照组,继续培养24h 后,MTT 法染色,计算抑制率（1- 实验组/ 对照组）,实验重复3 次.
1.2.2 Annexin-V/PI 双染法联合流式细胞仪
检测穗花杉双黄酮对人胃癌细胞MGC-803的凋亡比率
将MGC-803 细胞接种于直径为6cm的培养皿,设2 个给药组以及1 个5-FU阳性对照组, 浓度分别为400μmol/L,200μmol/L,50μg/ml,以及1 个空白对照组,继续培养24h 后,Annexin-V 以及PI 双染色,用流式细胞仪检测细胞凋亡.
1.2.3 Western Bolt 实验
将细胞消化下来后,收集各浓度组相关蛋白,以Bradford 法测得各浓度组蛋白浓度,取20μg 蛋白上样量检测.经SDSPAGE 将蛋白分离后转到PVDF 膜上,随后以5% 脱脂奶粉溶液封闭PVDF 膜1h,一抗4℃过夜,次日二抗室温孵育,PBST漂洗15min,使用ECL 液进行发光和条带分析.
1.3 统计学分析
采用SPSS19.0 统计软件进行分析,数据以（ ）表示,各组之间比较采用t检验,以* 为P<0.05 为差异有统计学意义.
2 结果
2.1 穗花杉双黄酮对人胃癌细胞MGC-803的增殖抑制
在不同浓度的穗花杉双黄酮作用于MGC-803 细胞 24h 后, 与对照组相比,400μmol/L、200μmol/L 浓度组对MGC-803 细胞抑制率分别达到87.74%&plun;4.3%,56.74%&plun;9.3%,呈现浓度时间依赖关系（图1）.
2.2 穗花杉双黄酮对人胃癌细胞MGC-803凋亡的影响
流式细胞仪检测结果显示,穗花杉双黄酮在作用于人胃癌细胞MGC-803 24h后,流式细胞仪检测细胞早期凋亡结果示：随着给药浓度的增加,MGC-803 细胞早期凋亡率从5.95% 增加到19.18%、80.13%,5-FU 阳参组早期凋亡为10.25%（P<0.05）,与对照组相比具有统计学意义,并且随着给药浓度的增加各浓度组早期凋亡率呈上升趋势,呈浓度依赖关系（图2）.
2.3 穗花杉双黄酮对MGC-803 细胞凋亡相关基因表达的影响
Annexin-V/PI 双染法显示穗花杉双黄酮能诱导人胃癌细胞凋亡,继而我们运用Western Blot 实验进一步探讨其诱导MGC-803 细胞凋亡的分子机制.如图所示( 图3),穗花杉双黄酮作用于MGC-803 细胞24h后,与对照组相比,给药组Bax 基因条带随着给药浓度的上升其表达量明显增高,Bcl-2 基因条带随着给药浓度的增加表达量减小,为此我们可得出结论,穗花杉双黄酮其能上调人胃癌癌细胞MGC-803 Bax 蛋白表达下调Bcl-2 蛋白表达引起细胞凋亡.
3 讨论
肿瘤细胞的无限增殖生长是恶性肿瘤的特征之一.研究表明,细胞凋亡在恶性肿瘤的发病机制中起着非常重要的作用 [3].细胞凋亡不是一个被动的过程,而是一个主动过程,它涉及到很多方面如基因的激活、表达以及调控等.Bcl-2 家族蛋白是重要的细胞凋亡调节因子[4].因此, 研究Bcl-2 家族对于探索新的肿瘤治疗方法具有重要价值.
通过本实验,我们得出以下结论：（1）穗花杉双黄酮能和抑制人胃癌细胞MGC-803 的增殖,且这种抑制呈现出时间浓度依赖关系；（2）穗花杉双黄酮能够诱导细胞细胞凋亡；（3）其诱导细胞凋亡机制为上调Bax 的表达,下调Bcl-2 蛋白表达.
（通讯作者：薛刚）
参考文献
[ 1 ] W C h e n , R S Z h e n g , e t a l . C a n c e rStatistics in China, 2015[J]. CACANCER J CLIN 2016, 66:115-132.
[2] 孙丽娜. 卷柏的化学成分及其药理作用概述[J]. 辽宁中医药大学学报,2008,12:193-184.
[3] 冯群, 夏嫱. 基于细胞凋亡信号通路的抗菌肽抗肿瘤机制的研究进展[J].广东医学,2018,39(03):466-469.
[4] 寇玉辉, 张英俊, 谢洪明, 林兴龙,许娟.Bcl-2 蛋白及其相关药物的研究进展[J]. 系统医学,2018,3(13):193-195.
作者简介
徐洪霞,女,江苏省如皋市人.大学本科学历.药师.研究方向为药剂学研究方向.薛刚,男,江苏省如皋市人.硕士学位.主治医师.研究方向为肿瘤内科.
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