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PCR技术在食品微生物检测中的运用

摘　要：本研究介绍了PCR 检测技术的原理和使用的原料,并对其在微生物实际检测中的应用进行描述,说明PCR 技术的应用前景.

关键词：PCR；食品；微生物

Abstract：This study introduced the principle of PCR detection technology and the raw materials used,and described the application in the practical detection of microbes. Then the application prospect of PCRtechnology was explained.

Key words：PCR; Food; Microorgani

中图分类号：TS207.4

民以食为天,现在人们不再单单只要求能够吃饱,还要吃得安全、吃得放心.食品安全是关系民生的重大问题,但近些年的食品安全问题层出不穷,前些年的毒奶粉事件之后又是连续的毒馒头、地沟油和水果农药含量超标等食品安全问题.这迫切要求提高食品的检测技术,以保证人们的饮食安全.食品中微生物含量的检测是食品检测中非常重要的一环,很多食物无法食用就是因为微生物的含量超标,加速了食物的腐败.近些年来,PCR 检测技术逐渐出现在人们的视线中,该技术因其快速、简便、准确的优点受到业内专业人士的青睐.

1　PCR 技术介绍

1.1　PCR 技术原理

PCR 技术早在1971 年的时候由Khorana 提出了设想,在当时这种技术被认为是不可能的,后来经过十几年的发展,到了1985 年时被美国科学家KaryMullis 正式研究出来.PCR 技术（Polymerase ChainReaction,简称PCR）被研究出之后立即就成为基因工程中的重要技术手段,为食品的微生物检测领域带来了新的快捷的方法.目前,我国的食品检测科学工作者正致力于将PCR 技术应用在啤酒等日常食物的微生物含量的检测中,不但是我国,许多发达国家如美国、加拿大、日本等也在进行这项工作.利用PCR 技术进行检测的基本原理是在PCR 体系下将食物加温,如果食物中存在微生物,则它们的核酸序列由于外界的高温会发生变性.一般PCR 体系刚开始时温度可以达到94 ℃（温度不可以过高,否则微生物会被直接杀死）,将PCR 体系中的温度直接下调到55 ℃,再将体系温度升到72 ℃,引物会与模板DNA 结合,在DNA 聚合酶的作用下合成新的DNA 链,之后就是重复以上步骤.最后只要检测产物中是否含有特异性的DN段即可.特异性引物只可以生长在微生物上,而且比微生物要容易检测.这样的检测技术不但结果更加准确,还可以对目的片段进行测序,确定是何种微生物[1].

1.2　PCR 技术需要使用的原料

要想利用PCR 技术,需要多种原料相互作用.由于PCR 技术的进步,目前使用的原料较之以前又有增加.①特异性的引物,这种引物必须事先准备好,这些引物只能与微生物发生关系,不能够随意结合到食物的其他成分上,且不可以过长,最好是15 ～ 20 个碱基长度.引物之间不可以发生互补反应,引物的设计和合成直接决定了PCR 技术能否成功,因此必须要严格对待.② DNA 聚合酶,主要作用是促使引物与微生物的DNA 结合.引物是一小段特定的DNA,但是要使其自动与微生物DNA 结合存在一定的困难,而DNA 聚合酶具有一定的催化功能,可促使这一目标达成.现阶段使用的主要是Tap DNA 酶,这种聚合酶具有良好的耐高温性,即便是在90 ℃下也不会失活.③缓冲液.一般而言,缓冲液与DNA 聚合酶是配套使用的,因为聚合酶的活性比较差,容易受到外界物质的影响,所以需要一定的保护.在缓冲液的作用下,引物与微生物之间更容易发生联系.④ Zn2+离子,它可为聚合酶提供足够的活力,保证其发挥良好的催化作用.Zn2+ 离子浓度直接会影响PCR 产物的数量,因此在进行检测时对于Zn2+ 的浓度一定要掌握好,否则测量出的结果将会不准确[2].

2　PCR 技术的实际应用

2.1　对食品中致病菌的检测

食品中的致病菌对于人体的健康有很大的危害,且致病菌的种类很多,如立克次氏体、衣原体、支原体、病毒、真菌等,为了保证食物不会对人体产生危害,这些致病菌的含量必须控制在合理范围内.在检测时,首先需要将这些致病菌的样本提取出来,通过高速离心的方式将致病菌分离出来,在高温条件下将它们裂解得到核酸.之后要研究致病菌DNA 的排列顺序,尽可能选择出致病菌群中有代表性的DNA 片段,在选择靶DNA 后根据其序列研制能与之结合的特异性引物,以上工作做好之后才可以对食物中的致病菌含量进行检测,只要检测到含有引物的DNA 中具有之前选定好的靶DNA 片段即表明这个是致病菌细胞.目前,测定食物中的沙门氏菌、变形弧菌、大肠杆菌等致病菌都采用这种方式,而且经过多次验证,PCR 技术比传统检测方式更加迅速、精确.

2.2　对食品中乳酸菌的检测

乳酸菌是一类可以产生乳酸的细菌的总称,目前发现的大部分乳酸菌都是有益菌,特别是在促进人类健康生长、帮助肠胃消化、改善肠道功能、降低血清内的胆固醇含量、提高机体的免疫力这些方面有很大的帮助,但其中一部分乳酸菌对人体有害,所以人们在购买食物时对于乳酸菌的含量格外看重,这就要求对于乳酸菌含量的测量也必须更加准确.对于乳酸菌的检测,我国开始研究的时间比较早,科研人员发现乳酸菌的DNA 序列在1414~1432 位置的21 个碱基排列非常有代表性,而且并不是只有一种乳酸菌拥有这种排列,双歧杆菌等前前后后共有32 种乳酸菌被发现具有此代表性的碱基排列,因此目前对乳酸菌含量的检测主要是针对这21 个碱基序列.要想得到这个序列,只需要利用SDS 方法将乳酸菌细胞裂解,再利用蛋白酶将细胞中的蛋白质去掉即可得到完整的乳酸菌核酸,再将自己所需的基因片段提取出来研究相应的引物,因为这个片段是乳酸菌特有的,所以不用担心引物会与其他物质结合,从而达到检测乳酸菌含量的目的.

2.3　对食品中啤酒腐败菌的检测

啤酒是人们生活中常见的食品,而且目前我国的啤酒产量很大,啤酒的种类也很多.众所周知,啤酒是通过发酵得到的,其中扮演着重要角色的就是乳酸杆菌.啤酒的主要原料啤酒花中含有一定量的异A 酸,这种酸有一定的抑菌作用,但是乳酸杆菌特别是乳杆菌对这种酸的存在有很大的影响,有日本学者认为啤酒的腐败与乳杆菌有直接关系.经过研究发现,软杆菌上能够抑制异A 酸生长的是一种horA 基因,而能够引起啤酒变质的乳杆菌几乎都含有这种基因,从而证明了horA 基因对啤酒花存在一定的抗性.在得到这个结论之后,日本的科研人员立刻根据horA 的基因顺序合成了特异性引物,再加上DNA 聚合酶和乳杆菌的DNA提取液,利用电泳对最后的产物进行检测,得到的结论与之前他们调配的浓度十分接近,由此啤酒中的腐败菌检测手段被研发出来,这种方法检测时间只需要6 h ,而传统的平板培养方法至少需要3 d ,在效率上有了很大的提高.

3　结语

食品的检测在朝着高效、快捷、方便的方向发展,PCR 技术无疑是满足以上需求的.但实际上,PCR 技术还存在着一定的缺陷,如对于细胞内存在能够破坏聚合酶的真细菌就无法使用该技术.但是,相信在不久的将来,PCR 技术一定可以完善自身,不再仅仅局限于食物的微生物检测,人体免疫学、分子生物学都有可能使用到PCR 技术.

参考文献：

[1] 李　勤,盛占武,孙志高,等. 实时荧光定量PCR技术在食品微生物检测和研究中的应用[J]. 四川食品与发酵,2010,42（5）：9-12.

[2] 徐　岩,张丽萍,顾国贤. 聚合酶链式反应（PCR）技术鉴定啤酒腐败菌的最新进展[J]. 酿酒科技,2000,27（5）：71-74.

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