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三种有机磷阻燃剂对蚯蚓的氧化胁迫效应
摘 要：以赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）为受试生物,通过滤纸接触法研究磷酸三甲苯酯（TCP）、磷酸-2-乙基己基二苯酯（EHDP）和磷酸三苯酯（TPP）三种污染物对蚯蚓的毒性效应.结果显示：随着TCP暴露浓度的增加,蚯蚓体内总超氧化物歧化酶（SOD）呈现先上升后逐渐下降的趋势,低浓度（0.0001 mg/cm2）时被显著诱导,高浓度（0.1 mg/cm2）时被显著抑制.EHDP和TPP随浓度增加,SOD活性均被刺激.TCP、EHDP、TPP胁迫下,蚯蚓体内过氧化氢酶（CAT）活性随浓度增加呈现上升趋势,依次在0.01 mg/cm2、0.001 mg/cm2、0.1 mg/cm2时,与对照相比,表现出显著差异.TCP胁迫下,蚯蚓体内丙二醛（MDA）呈现先下降后上升的趋势,而EHDP和TPP随浓度增加,MDA均被诱导,而TPP>0.001 mg/cm2,MDA被持续诱导且作用更为显著.
关键词：有机磷阻燃剂；蚯蚓；氧化胁迫
0 引言
随着溴系阻燃剂（BFR）在全球范围内的限制使用,有机磷阻燃剂（OPFRs）作为其替代品,需求量和使用量正快速增长.OPFRs是一种阻燃性能良好的添加性阻燃剂,与BFR类似,它在生产和使用中向环境中释放,具有环境持留性,且对人体有神经、生殖、致癌等毒性.目前,OPFRs已在各种环境介质中广泛存在,并通过空气、灰尘、饮用水等途径进入人体,对人体健康造成潜在危害.地表水、河流、湖泊、污水处理厂的出水口、进水口、沉积物、污泥中亦普遍检测出OPFRs,土壤作为污染物的“源”和“汇”,使得部分OPFRs在此蓄积,进入生物体内,随食物链迁移.在日本温室大棚附近的土壤中检出TCP是含量最高的OPFRs,它主要来自农用塑料膜的释放.采自大学校园的土壤中主要污染物为TCPP、TPP和TCEP,其中TPP浓度较高.
国内外学者对蚯蚓的生态毒理学行为进行了大量研究,但主要集中在农药、重金属、多环芳烃等污染物对蚯蚓的毒害方面,关于TPP、TCP和EHDP对蚯蚓毒理作用的研究甚少.鉴于此,本文根据国际标准试验方法（OECD,1984）中的滤纸接触法[8],研究了不同浓度的TPP、TCP和EHDP暴露对赤子爱胜蚓的抗氧化物酶如SOD、CAT以及MDA的影响,初步探讨其致毒机理,以期为三种污染物对蚯蚓的毒理诊断提供一定的科学依据.
1 材料与方法
1.1 实验材料
1）动物.赤子爱胜蚓（Eisenia foetida）,购自安徽欣豪蚯蚓生态养殖有限公司.选择体重300～400 mg,环带明显、大小相近的成蚓进行实验.
2）药品与器材.TPP（分析纯：99%）、TCP（分析纯：99%）和EHDP（色谱纯：90%）均购自百灵威.SOD、CAT和MDA试剂盒均购自于南京建成生物研究所.助溶剂二氯甲烷为色谱纯,由南京晚晴试剂公司提供.台式高速冷冻离心机（Labofuge 400R,德国）,紫外-可见分光光度计（UV-2450,岛津）,数显恒温水浴锅（HH-2,金坛市友联仪器研究所）,智能人工气候箱（杭州琦胜电子科技有限公司）.
1.2 滤纸法蚯蚓染毒
参考中华人民共和国国家标准发布的蚯蚓对化学品急性毒性试验中所描述的方法并加以修订,进行滤纸法急性毒性试验.试验用直径为9 cm的培养皿,每个培养皿的底部垫有一张直径为9 cm的滤纸,用二氯甲烷溶解暴露物配成系列浓度梯度（0 mg/cm2、0.0001 mg/cm2、0.001 mg/cm2、0.01 mg/cm2、0.1 mg/cm2）的溶液,均匀洒在滤纸上（2 mL的溶液可以将直径为9 cm的滤纸均匀地润湿）,空白对照组直接将2 mL二氯甲烷均匀地洒在滤纸上.在通风厨中待二氯甲烷挥发干后加入2 mL蒸馏水打湿滤纸,将清肠1天的蚯蚓放入培养皿中,保鲜膜封口后扎空,置于智能人工气候箱中培养,温度控制在为（22&plun;2）℃、湿度约为75%的条件下培养,并定期补水保湿.每一处理3个平行,每个平行分别加入5条体重、大小相近的蚯蚓（约350 mg）,以溶剂二氯甲烷污染为空白对照.暴露24 h后采样测定其组织的酶活性.在暴露期间清除死掉的蚯蚓,防止对其他蚯蚓的影响.
1.3 样品的制备与分析测定
1）蚯蚓组织匀浆液的制备.以预冷的生理盐水作为蚯蚓组织匀浆液.取1条经12 h清肠的蚯蚓,用生理盐水洗净后用滤纸吸干表面水分,称重并记录.将蚯蚓放入离心管中,加入9倍体重的匀浆液,快速剪碎,使用组织匀浆机匀浆,制成10％的组织匀浆.将匀浆液分装于2 mL离心管.以下操作均在4℃条件下进行：将匀浆液用3 000 r/min离心10 min,吸取上清液,将离心管编号分装,存放-20℃冰箱,供不同酶检测时使用.
2）蛋白质含量的测定.蛋白质含量测定采用改良考马斯亮蓝（Bradiord）法,按照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行.
3）抗氧化能力测定.SOD、CAT、MDA的测定,依照南京建成生物工程研究所提供的试剂盒说明书进行测定.
2 结果
2.1 TCP、EHDP、TPP对蚯蚓SOD活性的影响
从图1可以看出蚯蚓暴露于TCP 24 h后,随着暴露浓度的升高,SOD活性呈先降低后升高趋势；而蚯蚓暴露于EHDP和TPP中24 h后,SOD活性随着暴露浓度的升高呈现增长趋势.与对照组相比,暴露于EHDP的全部处理组（0.0001 mg/cm2、0.001 mg/cm2、0.01 mg/cm2、0.1 mg/cm2）,SOD均被显著诱导,分别为对照组的1.11、1.16、1.37、1.60倍.而暴露于TCP的较低处理组（0.0001 mg/cm2）下,SOD被显著诱导,为对照组的1.46倍,在较高处理组（0.01 mg/cm2和0.1 mg/cm2）,SOD被显著抑制,分别为对照组的87%和53%.而暴露于TPP的较高处理组（0.01 mg/cm2和0.1 mg/cm2）,SOD被显著提高,分别为对照组的1.56、1.54倍.
2.2 TCP、EHDP、TPP对蚯蚓CAT活性的影响
从图2可以看出与对照组相比,在较低（0.0001 mg/cm2）的TCP、EHDP、TPP滤纸暴露浓度下,蚯蚓体内CAT活性无显著性变化；而在较高（0.001 mg/cm2、0.01 mg/cm2、0.1 mg/cm2）的TCP、EHDP、TPP滤纸暴露浓度下,蚯蚓体内CAT活性基本随着浓度增大而增大.与对照相比,TCP、EHDP、TPP分别在浓度为0.01 mg/cm2、0.001 mg/cm2、0.1 mg/cm2时,蚯蚓体内的CAT活性开始表现出显著差异,分别为对照的1.71、1.52、2.32倍,表明CAT活性在评价EHDP对蚯蚓的污染时更为敏感.
2.3 TCP、EHDP、TPP对蚯蚓MDA含量的影响
从图3可以看出蚯蚓暴露于TCP 24 h后,随着浓度增加,MDA含量呈现降低后增加的趋势；而蚯蚓暴露于EHDP和TPP 24 h后,随着浓度增加,MDA含量表现逐渐上升的趋势.与对照相比,TCP在较低浓度（0.0001 mg/cm2）时,MDA被显著抑制,为对照的68%；EHDP和TPP在中等浓度（0.001 mg/cm2）时,均被显著诱导,分别为对照的1.18倍、2.01倍；TCP、EHDP、TPP三者在最大浓度时,MDA被更为显著诱导,分别为对照的1.72倍、1.38倍、2.96倍.
3 讨论
SOD和CAT活性显著提高表明TCP、EHDP和TPP胁迫下蚯蚓体内活性氧自由基增多,蚯蚓体内抗氧化防御系统打开,刺激SOD和CAT的合成来清除过多的氧自由基,从而减少细胞膜的氧化损伤,这是蚯蚓对逆境环境的适应性反应.EHDP和TPP随着浓度的增加,SOD和CAT活性逐渐增加,说明实验浓度范围内EHDP和TPP的在蚯蚓的耐受限度内,不会对蚯蚓造成严重的氧化胁迫.王作彬的研究报道蚯蚓暴露于吡唑醚菌酯处理组的前21天,随浓度增大,SOD较多呈现出被激活状态[9].当TCP浓度大于0.01 mg/cm2时,SOD活性显著受到抑制,这说明在大于0.01 mg/cm2的TCP胁迫下,蚯蚓体内SOD活性经过在暴露初期提高后,蚯蚓体内氧自由基产生的数量超过了SOD消除自由基的能力,细胞开始受到毒害,CAT活性则继续增加,说明需要CAT活性增强来清除体内的活性氧.王飞菲等研究表明蚯蚓暴露在精喹禾灵中7天,SOD活性被先刺激后抑制.徐湘博等研究发现蚯蚓暴露于BDE-47 14天和28天时,CAT活性被显著诱导上升且差异显著.
在低剂量的TCP（0.0001 mg/cm2）暴露下,蚯蚓体内MDA含量降低,这可能是由于前期蚯蚓机体的活性氧被抗氧化酶系消除,抑制了脂质过氧化作用.在高剂量处理组（0.1 mg/cm2）MDA含量均显著高于对照水平,可能由于在TCP胁迫下ROS含量增加抑制抗氧化酶系活性,并且产生过量的活性簇引起了脂质过氧化作用.平令文等研究发现DEP对蚯蚓的影响出现一致的变化规律.EHDP和TPP胁迫下,随浓度增大MDA含量增加,马丽丽等研究发现老化30天的芘对蚯蚓的影响出现相似的变化规律.
4 结语
1）TCP、EHDP和TPP对蚯蚓组织抗氧化酶SOD、CAT和MDA响应各不相同,与对照相比,均在最大浓度（0.1 mg/cm2）被显著诱导.
2）TCP对SOD和MDA的变化影响表现出反向性,EHDP和TPP对SOD和MDA的变化影响表现出同步性,三者对CAT的变化影响表现出同步性.
参考文献
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