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英纯血马性格候选基因多态性和断奶行为相关性分析
摘 要：为减少断奶应激,同时为断奶前合理分群提供依据,本实验应用PCR-SSCP、PCR-RFLP技术分析脑源性神经营养因子（BDNF）、多巴胺-β-羧化酶基因（DBH）、5-HT转运体基因（SLC6A4-1、SLC6A4-2、SLC6A4-3）这5种与英纯血马性格有关的候选基因多态性,并与断奶行为进行相关性分析.结果显示BDNF基因中AB为优势基因型,DBH-2基因中AA为优势基因型,SLC6A4-1基因中AA为优势基因型,SLC6A4-2基因中AA为优势基因型,SLC6A4-3基因中AB为优势基因型；SLC6A4-1、SLC6A4-2和SLC6A4-3基因多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态而BDNF和DBH-2基因多态位点不处于Hardy-Weinberg平衡状态.SLC6A4-1基因显著影响马驹踢、咬、啃木头（墙）的行为（P<0.05）；SLC6A4-2基因对马驹断奶行为影响不显著（P＞0.05）；SLC6A4-3基因显著影响马驹的踢、啃木头（墙）、翻滚等行为（P<0.05）.因此SLC6A4-1基因和SLC6A4-3基因可以作为与断奶行为相关的候选基因,用于马产业生产实践中断奶应激防控的分子标记辅助选择.
关键词：英纯血马；性格基因；断奶行为；相关分析
0 引言
动物行为很大程度上受到遗传的影响,动物行为遗传学研究目标是寻找决定行为性状的候选基因.全世界各国科学家已经广泛关注动物行为遗传学,特别是欧洲一些动物行为学家在动物行为遗传学研究上做出了杰出的贡献[1].目前,已有大量研究证实动物性格行为性状和候选基因多态性之间存在紧密的相关性[2].Tolwani[3]报道当脑源性神经营养因子（BDNF）缺乏时会导致动物出现狂燥抑郁症.杨虹[2]研究结果表明多巴胺-β-羧化酶基因DBH（1）基因上存在的G758A位点显著影响着蒙古马对其他马之间友好行为.5-HT转运体基因是在精神病学领域中被研究最多的一个基因.SLC6A4基因是5-HT转运体基因的一种基因形式.Li等[4]研究表明缺乏5-HTT转运体基因的老鼠表现出很强的焦虑行为.
为了获得最大利益,人工断奶已被广泛地应用到家畜生产中[5].人工断奶会导致一系列的断奶应激反应,Harland[6]报道断奶应激使家畜患疾病的风险增加,Moberg[7]认为人工断奶是影响家畜生长发育和易患疾病的动物福利问题.断奶应激常常导致异常行为发生[8],Heleski等[9]报道断奶会导致马驹异常行为（比如啃墙、踢墙、反复扒墙）频率增加.Haley等[10]发现断奶引起马驹攻击行为频率增多.因此在断奶前根据马驹的性格进行合理分群,对减少断奶应激、提高马驹和母马健康福利有重要意义.
本实验以英纯血马为研究对象,对5个性格候选基因（BDNF、DBH-2、SLC6A4-1、SLC6A4-2、SLC6A4-3基因）的多态性进行研究,分析其多态性与马驹断奶行为的相关性.以期为性格候选基因作为判定评估英纯血马断奶行为差异的辅助遗传标记奠定基础,为英纯血马驹的后期生长发育、养殖效益和提高马驹的动物福利提供科学依据.
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 样品采集.本试验以英纯血马驹和它们的母马为研究对象,样品采自新疆伊犁哈萨克自治州昭苏县新疆伊犁马研究繁育中心,共采集15匹6～8月龄英纯血马驹和15匹母马断奶当天的血液样品,置于2.5 mL EDTA抗凝管中带回实验室,-20℃保存备用.采用电视摄像机观察和记录15匹马驹断奶当天24 h的断奶行为（间隔30 min为一个时间段）.观察的行为评价指标参考国外对马驹断奶行为的习性谱（表1）.
1.1.2 主要试剂.三羟氨基甲烷（Tris）：Amresco；乙二胺四乙酸二钠（Na2EDTA·2H20）：Amresco；十二烷基磺酸钠（SDS）：Amresco美国；二甲苯菁FF：Sigma；溴酚蓝：Sigma；琼脂糖（Agrose）：Biowest；去离子甲酰胺：Amresco；丙稀酰胺（Acr）：Sigma；N-N′-亚双丙烯酰胺：Amresco过硫酸铵：Sigma；TEMED：Sigma；2XTaq PCR MasterMix：天根；Marker DL2000：天根；GoldView核酸染料：北京赛百盛生物工程公司；内切酶（Hha I、Eco 0109 I）：Fermentas,加拿大.
1.2 引物设计与合成
参考文献[2]设计引物,并由Invitrogen公司合成.
1.3 PCR扩增
参考分子生物技术实验手册中Tris-饱和酚法提取血液组织DNA.PCR反应体系25 μL：Primer F（10 pmol）1 μL,Primer R（10 pmol）1 μL,DNA Template（100 ng/μL）1 μL,2×PCR Mix 15 μL,ddH20 7 μL.PCR反应程序：95℃预变性5 min,95℃变性30 s,退火温度和时间见表2,72℃延伸10 min,4℃保存.取2 μL PCR扩增产物进行电泳检测,凝胶成像系统下观察、拍照.
1.4 PCR-SSCP分析
除了BDNF、DBH-2、SLC6A4-1基因PCR产物通过10％非变性聚丙烯酰胺凝胶120 V凝胶电泳8 h、硝酸银染色检测外,SLC6A4-2、SLC6A4-3基因扩增产物分别用HhaI和Eco 0109I限制性内切酶进行酶切.酶切反应体系见表3,酶切产物通过10％非变性聚丙烯酰胺凝胶120 V电泳2.0 h后银染并在凝胶成像系统下观察、拍照.
1.5 数据统计分析
通过回放摄像记录统计和整理15匹马驹断奶当天所有行为的行为频率（times/h）.根据不同基因PCR-RFLP检测结果,采用POPGENE32分析软件计算各基因位点基因型频率、等位基因频率,并进行Hardy-Weinber平衡性检测.利用R2.14.2语言软件对不同基因型与马驹断奶当天行为进行显著性检验,以P<0.05作为差异显著的判定依据,以平均值&plun;标准误（Mean&plun;S.E）表示试验结果.
2 结果
2.1 PCR扩增结果
分别取2 μL PCR扩增产物,经2.0%琼脂糖凝胶电泳检测,结果发现BDNF、DBH-2、SLC6A4-1,SLC6A4-2、SLC6A4-3基因PCR扩增产物的大小为342 bp,271 bp,352 bp,320 bp,321 bp,与预期片段大小相一致,且没有特异性扩增条带,可用于后续试验.
2.2 PCR-RFLP分析
BDNF、DBH-2、SLC6A4-1基因扩增产物经过10％非变性聚丙烯酰胺凝胶120 V凝胶电泳8 h.BDNF基因的PCR产物电泳检测出2种带型：AA型和AB型（图1）.DBH-2基因的PCR产物电泳检测出2种带型：AA型和AB型（图2）.由图3可知SLC6A4-1基因的PCR产物电泳检测出2种带型：AA型和AB型.SLC6A4-2基因扩增产物用HhaI酶酶切后,通过10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银染色后共出现2种带型AA型和AB型（图4）.SLC6A4-3基因扩增产物用Eco0109I酶酶切后,通过10％的非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳、硝酸银染色后共出现2种带型AA型和AB型（图5）.
2.3 基因型频率与基因频率
由表4可知,BDNF基因中AB为优势基因型,DBH-2基因中AA为优势基因型；经X2检验可知BDNF和DBH-2基因多态位点并不处于Hardy-Weinberg平衡状态.SLC6A4-1基因中AA为优势基因型,SLC6A4-2基因中AA为优势基因型,SLC6A4-3基因中AB为优势基因型；经X2检验可知SLC6A4-1、SLC6A4-2和SLC6A4-3基因多态位点处于Hardy-Weinberg平衡状态.
2.4 SLC6A4-1、SLC6A4-2和SLC6A4-3基因与英纯血马驹断奶行为性状的相关性分析
通过R2.14.2语言分析发现（表5）：SLC6A4-1基因显著影响马驹踢、咬、啃木头（墙）的行为（P<0.05）；SLC6A4-2基因对马驹行为影响不显著；SLC6A4-3基因显著影响马驹的踢、啃木头（墙）、翻滚等行为（P<0.05）.
3 讨论
行为性状是由多基因调控的数量性状[11],受到环境因素影响较大,参与行为的大多基因都已经成为了行为遗传学的研究热点.在国内对马行为遗传学研究并不多,本实验选取了5个性格候选基因.杨虹[2]研究发现BDNF基因显著影响了蒙古马的咬人行为和焦虑行为.李小慧[12]发现犬DBH基因第899个碱基存在一个C-T突变.本实验对英纯血马性格候选基因分析发现,BDNF基因片段有多态位点,但经过Hardy—Weinberg检验显示该多态位点遗传并不稳定,因此不宜与断奶行为进行相关分析.
DBH（多巴胺—β—羧化酶）位于大脑的结节核前方和后脑末端,李小慧[12]研究表明在犬DBH基因第899个碱基上存在着C-T突变.杨虹[2]研究发现DBH（1）基因758位点上G-A 替换显著影响蒙古马友好和忍耐力行为.本实验对英纯血马DBH-2基因发现该基因具有多态性,但经过X2检验该位点没有处在Hardy-Weinberg平衡状态.说明DBH-2基因遗传稳定性较差,无法用于遗传学分析.
5-HT转运体基因被广泛应用在精神病学领域.SLC6A4基因是5-HT转运体基因的一种基因形式.Li等[4]研究发现小鼠缺乏5-HTT转运体基因会出现强烈的焦虑行为.杨虹[2]研究表明SLC6A4-1基因上1362位点上T到C转化会显著影响蒙古马的惊慌性、恐慌性、胆怯性和神经质以及对马具的应激反应,并且极显著地影响蒙古马独立性行为；本实验发现英纯血马SLC6A4-1基因与马驹断奶行为中的踢、咬和啃木头（墙）行为存在一定相关性.SLC6A4-3基因显著影响马驹断奶行为中的踢、啃木头（墙）和翻滚行为.
4 结语
英纯血马5个与断奶有关的性格基因（BDNF、DBH-2、SLC6A4-1、SLC6A4-2、SLC6A4-3）均表现出较高的多态性,其中BDNF和DBH-2基因遗传不稳定；与断奶行为相关的SLC6A4-1基因和SLC6A4-3基因在英纯血马中存在多态性,可以作为英纯血马断奶行为相关的候选基因.用于马产业生产实践中断奶应激防控的分子标记辅助选择.
参考文献
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[12]李小慧.犬主要行为性状及其相关基因的研究[D].南京农业大学,2006.
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