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猪细小病毒致PK-15细胞病变的荧光显微镜和电镜观察
方振华,沈振国,孙 倩
（海南职业技术学院热带农业技术学院,海南海口570216）
摘 要：利用荧光显微镜、扫描和透射电镜对猪细小病毒病(PPV)感染的PK-15细胞进行形态结构观察.结果显示．PPV能诱导猪肾（PK -15）细胞发生典型病变,病变程度随感染时间而加剧.被感染的细胞皱缩、变圆,细胞核浓染、碎裂；超微结构表现为细胞微绒毛消失,有较多的球状突起；粗面内质网严重扩张,线粒体嵴肿胀、模糊不清,核染色质固缩并边集于核膜,在胞核和胞浆内有较多子代病毒聚集；感染的后期出现了细胞膜凹陷包裹胞质成分的凋亡小体,胞浆中细胞器空泡化严重,细胞核碎裂.本研究从细胞水平上了解PPV的致病过程,为其致病机理的研究奠定理论基础.
关键词：猪细小病毒；PK- 15细胞；细胞病变；超微结构
中图分类号：S852
文献标识码：A
文章编号：2095-9737(2017)07-0001-02
收稿日期：2017-03-31
基金项目：海南省自然科学基金项目(20153086；20153081)
第一作者简介：方振华（1980 -）,男,讲师,硕士,研究方向：动物营养与动物疾病.E-mail:okay1688@163．com
猪细小病毒引起的猪细小病毒病是猪的一种繁殖障碍性传染病,其临床症状主要为妊娠母猪流产,初产母猪产畸形胎、木乃伊胎、死胎等.PPV可在猪的多种传代细胞,如猪肾细胞、猪睾丸(ST)细胞、鸡胚成纤维细胞(CEF)、非洲绿猴肾细胞( Vero)等中增殖,并引起明显的细胞病变r3_7 J.PPV和其他病毒一样在细胞内的生存周期包括吸附、穿人、脱壳、复制、包装和释放六个阶段,其入侵宿主细胞后会对细胞的生长活性和形态结构造成较大影响.目前关于PPV感染宿主细胞的超微结构的研究,还没有较为系统的资料.
为了解PPV感染过程中宿主细胞形态结构变化,本研究以PPV体外感染PK -15细胞为模型,通过荧光显微镜、扫描和透射电镜观察细胞内超微结构病变特点,从细胞水平上了解PPV的致病过程,为致病机理的研究奠定理论基础.
1 材料与方法
1.1 材料
PPV和PK -15细胞由本室提供.
1.2 细胞培养与病毒接种
PK -15细胞应用10%胎牛血清( FBS)的DMEM培养基培养.待细胞丰度为80%时接种PPV,37℃吸附th,弃去病毒液,用2%胎牛血清的细胞维持液继续培养.
1.3 DAPI染色
对数生长期PK -15细胞接种于24孔细胞培养板,过夜培养后接种PPV( MOI：1),于感染24 h和48 h吸弃培养液,用4%多聚甲醛室温固定th,PBS洗涤3次,每次5 min.用DAPI染液（终浓度为0.1μg／ml）室温避光染色30 min,吸弃染液,PBS洗涤,荧光显微镜下观察,拍照.
1.4扫描电镜样品制备
将盖玻片置于6孔细胞培养板中,对数生长期PK - 15细胞接种于培养板,约长成80%丰度接种PPV( MOI：1),于感染的24 h和48 h取出细胞爬片,PBS漂洗3次,2.5%戊二醛固定4h,PBS漂洗3次,10%的四氧化锇后固定2h,乙醇和丙酮梯度脱水,乙酸异戊酯置换,临界点干燥,表面喷金,S- 3000N型SEM扫描电镜(Hitachi)观察,拍照.
1.5 透射电镜样品制备
病毒感染的24 h和48 h收集细胞,用PBS清洗3次后转入1.5 mL离心管,2000 r/min离心3 min,吸弃上清液,缓缓加入2. 5%戊二醛1 mL,4℃冰箱静置2h,预冷的PBS漂洗3次,再以1%锇酸固定2h,梯度乙醇脱水,环氧树脂包埋,修块,切片,铀染,JEM- 2100型透射电镜(JOEL)观察,拍照.
2 结果
2.1 荧光显微镜下细胞形态的变化
对照组细胞核被DAPI染色,呈均匀蓝色荧光,细胞核膜完整,染色质均匀（图1 a）,PPV接种PK-15细胞24 h即有细胞核出现皱缩现象,染色质边集（图lb）,病毒感染48 h时,核染色质固缩的细胞数量显著增多,核明显发生聚缩和碎裂,可见到细胞膜失去完整性的晚期凋亡细胞（图1 c）.
2.2 PPV致PK-15细胞病变的扫描电镜观察
正常的PK- 15细胞表面微绒毛多而密,细胞表面光滑,细胞间隙清晰可见（图2a）；PPV感染24 h后细胞体积变小,微绒毛消失,细胞表面变得粗糙不平,有较多的圆球状突起（图2b）；病毒感染48 h细胞皱缩更加明显,有的细胞出现了细胞膜凹陷包裹细胞内容物的凋亡小体（图2 c）.
2.3 PPV致PK-15细胞病变的透射电镜观察
正常细胞的细胞膜及核膜完整,细胞器形态结构完整,胞浆内有大量粗面内质网及核糖体,核仁清晰,异染色质呈散在斑点状（图3 a）；PPV感染24 h后细胞内粗面内质网严重扩张呈囊状,线粒体嵴肿胀、变暗,模糊不清,细胞核染色质固缩,聚集于核膜周边,在胞核和胞浆内有较多的子代病毒聚集（图3b）；病毒感染48 h,胞浆内有较多空泡,细胞器空泡化严重,几乎无法辨认,细胞核碎裂,细胞内可见大量病毒颗粒释放出胞（图3 c）.
3讨论
PPV对体外培养的细胞具有一定的宿主选择性,虽可在猪原代细胞和多种传代细胞包括PK -15、ST、A-72、IBRS-2、MDBK、Hela等上生长或繁殖,但引起的细胞病变特性却并不相同.据殷华平等、唐波等报道PPV在猪睾丸传代细胞ST及猪肾传代细胞PK-15、IBRS-2上传代后均能出现细胞病变,表现为细胞内出现弥散性颗粒,细胞变圆,有的细胞出现细胞间的融合、聚集,最后病变细胞开始崩解脱落,出现空斑.张磊等报道PPV在F81细胞较PK -15细胞更容易培养,接种后18 h有部分细胞形态发生变化,感染24 h后大量细胞发生病变.但国内对于PPV感染细胞的超微结构的研究,还没有比较系统的资料报道,仅局限于普通显微镜下的病变特征.本研究选用PPV感染的敏感细胞系PK-15单层细胞制作扫描和投射电镜样品,可完整地观察到宿主细胞超微结构的变化过程.
本研究发现PPV在PK-15细胞内增殖能引起明显的细胞病变,如细胞变圆、核固缩等,继而出现细胞碎裂现象,这些普通光镜下的变化和其他学者研究结果相同；本研究应用DAPI染色,在荧光显微镜下观察细胞核的变化,发现随着PPV感染时间的延长,细胞核皱缩、变圆、染色质边集、碎裂,出现了细胞凋亡的典型特征,该结果与相海苓的研究结果一致.在病毒增殖过程中细胞超微结构也发生了相应的变化,主要表现为：PPV感染的24 h后,细胞微绒毛消失,表面粗糙不平,有较多的圆球状突起,粗面内质网严重扩张,而内质网的结构病变致使其功能受到严重破坏,进而引起细胞的正常代谢障碍,促进细胞凋亡的早期改变.此外PPV感染的细胞线粒体嵴肿胀、变暗,模糊不清,而线粒体是真核生物进行氧化代谢的部位,除负责细胞内氧化磷酸化,为细胞的活动提供了能量外,线粒体也与细胞凋亡过程紧密相关.PPV感染的细胞核染色质边集或分布异常,可见凋亡早期改变,说明线粒体的病变使细胞的能量代谢途径受到严重破坏,从而诱导细胞死亡或凋亡的发生.病毒感染的后期阶段,扫描电镜观察到细胞膜凹陷包裹细胞内容物成分的凋亡小体.投射电镜观察发现胞浆内有较多空泡,尤其细胞器空泡化严重,几乎无法辨认.本试验研究结果为了解PPV感染引起的细胞变化提供有力的超微病理学资料,有助于认识猪细小病毒与宿主细胞的相互作用,为猪细小病毒病的形态学诊断及致病机理的研究提供重要依据.
细胞论文范文结:
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