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高强度力量训练对青年男性淋巴细胞凋亡的影响与其机制
摘 要：目的：观察高强度力量训练（HST）或中等强度力量训练（MST）对淋巴细胞凋亡的影响并探讨其可能机制.方法：20名青年男性分别进行一次急性HST和MST,分别于训练前、训练后即刻、训练后3h以及训练后24h取静脉血测定淋巴细胞凋亡率、线粒体膜电位（MMP）、CD95受体、Bcl-2蛋白表达以及血清肿瘤坏死因子α（TNF-α）、白细胞介素6（IL-6）、C-反应蛋白（CRP）和皮质醇含量.将新鲜淋巴细胞与HST前的血清、HST后3h的血清、米非司酮（MIF,糖皮质激素受体阻断剂）预处理的HST后3h血清以及单独加入介质（分别为L-乳酸、rIL-6、rCRP和皮质醇）的培养基共培养24h,用流式细胞仪检测淋巴细胞凋亡率.结果：HST后3h淋巴细胞凋亡率、CD95受体、血清IL-6、CRP和皮质醇升高（P<0.05）,MMP和Bcl-2蛋白表达降低（P<0.05）,24h时除Bcl-2蛋白仍低于训练前（P<0.05）外,上述其他各指标均恢复至训练前水平（P>0.05）.HST后3h血清皮质醇含量与淋巴细胞凋亡率显著正相关（r＝0.69,P<0.05）.MST后所有指标均无显著性变化（P>0.05）.HST后3h血清与淋巴细胞共培养后细胞凋亡率明显高于训练前血清（P<0.05）.将淋巴细胞与单一血清介质进行共培养,其中L-乳酸、rIL-6和rCRP对淋巴细胞凋亡率均无显著性影响（P>0.05）,皮质醇则明显提高淋巴细胞凋亡率（P<0.05）,在训练后3h血清中加入MIF则显著降低淋巴细胞凋亡率（P<0.05）.结论：力量训练诱导淋巴细胞凋亡存在运动强度依赖性,皮质醇经由糖皮质激素受体介导的信号转导通路可能参与了高强度力量训练诱导淋巴细胞凋亡的过程.
关键词：力量训练；淋巴细胞；凋亡；机制
中图分类号：G804.2文献标识码：A文章编号：1006-2076(2018)06-0091-08
力量训练是运动员运动训练的有机组成部分,也是提高专项运动能力的重要手段[1].此外,力量训练在大众健身以及休闲体育中越来越受推崇[2-4].为刺激机体产生生理适应并提高专项运动能力,在力量训练实践中常采用一定比例的高强度大负荷训练内容.与有氧运动（或耐力训练）相比,力量训练对氧的需求量不高,对心肺刺激较小,其主要靶器官是骨骼肌,运动强度由肌肉承载负重以及最大重复次数决定[5].力量训练常伴随局部糖原耗竭和乳酸堆积（甚至酸中毒）,这是决定运动能力的主要生理学限制因素.高强度力量训练时肌肉承受高张力,加之离心收缩的影响,工作肌的完整性受损并最终导致肌肉损伤以及轻度炎症反应[6].此外,力量训练还能够激活下丘脑－垂体－肾上腺皮质轴,促进肾上腺皮质释放皮质醇激素,从而介导应激反应[7].因此,高强度力量训练可引发全身物质与能量代谢、炎症反应以及内分泌功能的变化.上述因素均可作用于循环中的淋巴细胞,诱导其活化甚至凋亡[8].尽管高强度力量训练广泛应用,然而其对于免疫功能的作用（激活或损害）知之甚少.Yarrow等[9]利用离心收缩诱导肌肉损伤探讨神经内分泌功能的反应与适应,但这一模型与力量训练在实践中的应用仍存在较大差异.近年来研究者针对不同强度和持续时间耐力训练（马拉松跑、剧烈跑台运动或蹬车运动等）对淋巴细胞活化和凋亡的影响进行了诸多报道并发现[10-12],淋巴细胞凋亡存在运动强度依赖性,高强度剧烈运动诱导其凋亡,而中等强度运动则并无此效应.但不同运动方式（如力量训练、高强度间歇训练）等对于淋巴细胞凋亡的作用和机制目前尚缺乏研究.
业已证实,多种介质参与了运动诱导淋巴细胞凋亡的病理生理过程[13].研究表明,细胞内外pH值的变化可调控细胞凋亡.剧烈运动时乳酸大量产生,血液pH下降,继而导致细胞凋亡甚至坏死.Samuvel等[14]的研究表明,在巨噬细胞中,乳酸可作为信号分子导致炎症因子表达上调.而剧烈运动亦可诱导全身炎症反应,同时伴急性期蛋白和细胞因子含量升高.多项研究证实,剧烈运动上调肿瘤坏死因子α（tumornecrosiactor-α,TNF-α）、白细胞介素6（interleukin-6,IL-6）和C-反应蛋白（C-reactionprotein,CRP）水平,上述介质可造成多种类型细胞发生凋亡[15].此外,糖皮质激素（glucocorticoids,GC）如皮质醇（cortisol）或皮质酮（corticosterone）可诱发淋巴细胞凋亡[12].小鼠胸腺细胞培养实验中给予与剧烈运动时相同浓度的皮质酮同样可诱导细胞凋亡[16],提示GC信号途径在运动诱导细胞凋亡中起重要作用.此外,运动前给予小鼠GC受体拮抗剂——米非司酮（mifepristone,MIF）预处理可抑制胸腺细胞DNA碎片化[17].
本研究的目的旨在观察高强度力量训练（high-intensitystrengthtraining,HST）或中等强度力量训练（moderate-intensitystrengthtraining,MST）对淋巴细胞凋亡的影响并探讨其可能机制.由于力量训练可诱导物质代谢、炎症因子和激素的变化,因此我们将淋巴细胞进行体外培养,观察与HST实验时相同浓度的乳酸、IL-6、CRP和皮质醇是否可诱导其凋亡.我们假设,力量训练诱导淋巴细胞凋亡存在运动强度依赖性,其机制可能与血清中多种介质的变化有关.
1对象与方法
1.1研究对象
20名青年男性,年龄（25.6&plun;2.7）岁,身高（1.78&plun;0.02）m,体重（77.2&plun;8.9）kg,身体质量指数（bodymassindex,BMI）为（24.3&plun;2.8）kg/m2.告知其实验目的、实验意义以及潜在风险后,表示自愿参加本试验并签订知情同意书.受试者身体健康、无心血管疾病、代谢性疾病、急慢性感染、烟酒嗜好以及服用药物,未经过专业训练,包括力量训练或耐力训练,即每周规律运动时间低于3h/周.嘱受试者实验前48h清淡饮食,禁止剧烈运动、饮用咖啡、吸烟以及饮酒.
1.2实验设计
受试者共进行4次实验室测试,每次间隔7天.第1次：熟悉实验流程与器械使用方法,测定身体形态学参数（身高、体重、BMI）；第2次：利用训练器械测定最大重复次数（repetitionmaximum,RM）；第3次：受试者进行一次HST并取静脉血；第4次：进行一次MST并取静脉血.分别于训练前、训练后即刻、训练后3h以及训练后24h取静脉血5mL,一部分全血用于细胞计数和淋巴细胞分离,另一部分全血离心（4℃,3000r/min）后取血清于-20℃冰箱冻存待测炎症因子和激素水平.
1.3RM测试
利用8种不同的训练器械测试肌肉的最大力量,即1RM,测试动作与动员主要肌群分别为：1）卧推（benchpress）——胸大肌；2）背阔肌下拉（latissimuspull-downs）——背阔肌；3）坐姿拉力器划船（seatedrows）——斜方肌和背阔肌；4）肩部推举（shoulderpress）——三角肌；5）腿屈伸（legpress）——股四头肌；6）肩部下拉（shoulderpull-downs）——肱三头肌；7）前臂弯举（bicepscurls）——肱二头肌；8）腿弯举（legcurls）——腘绳肌.先进行充分的准备活动（慢跑和拉伸）,然后通过增减配重找出只能重复10次（10RM）对应的负荷重量,此重量除以0.75,即为1RM[18].测试1RM的目的在于进行力量训练时控制每名受试者的负荷保持在同一相对运动强度上.
1.4力量训练方案
力量训练于清晨8∶00开始.一般性准备活动（慢跑和拉伸）后进行专项准备活动,即以30%1RM强度练习1.3中的8个动作,每个动作重复15次,共1组.休息10min后进行一次HST,强度为75%1RM,完成上述8个动作.间隔7天后,受试者于同一时间、相同动作模式完成一次MST,强度为60%1RM.为保证两次测试只存在运动强度差异,MST时每组完成8次,HST时每组完成10次（HST完成次数是MST的75%/60%＝1.25倍）,共3组,每个动作完成后间歇2min,组间（8个动作为1组）间歇3min,持续时间约90min.训练前、每组训练后测定心率（heartrate,HR）和乳酸（lacticacid,La）,仪器分别为PolarS810型遥测心率表（芬兰）和YSI-1500型血乳酸分析仪（美国）.
1.5白细胞计数
取EDTA抗凝血300μL,利用五分类血细胞分析仪（LH750,美国贝克曼库尔特公司）测定白细胞计数、淋巴细胞计数和粒细胞计数.
1.6淋巴细胞分离
利用密度梯度离心法分离淋巴细胞.取抗凝血2mL,用Hank’s液等倍稀释后加入等体积淋巴细胞分离液,2000r/min离心30min,弃上清并收集淋巴细胞层.
1.7细胞表面凋亡、坏死标志物,细胞活化以及线粒体膜电位检测
用Annexin-VFITC和碘化丙啶（propidiumiodide,PI）标记淋巴细胞分别测定凋亡和坏死.线粒体膜电位（mitochondrialmembranepotential,MMP）用DiOC6荧光染色法测定,即取105细胞以40nmDiOC6染色30min.为进一步检测淋巴细胞表型和功能,用CD95受体（Fas受体）、CD95配体（Fas配体）和CD69（细胞激活表面标志物）抗体标记细胞,用流式细胞仪（Beckman,德国）检测分析.
1.8Bcl-2蛋白检测
利用Westernimmunoblotting法检测Bcl-2蛋白含量.裂解液裂解淋巴细胞后测定总蛋白含量,取20μg蛋白样品经15%SDS-PAGE分离转移于PVDF膜.一抗孵育过夜,二抗孵育1h,ECL显影.采用凝胶系统分析系统扫描各条带灰度值,以甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase,GAPDH）为内参蛋白,计算各组条带的相对表达量.
1.9炎症因子和激素水平测定
血清TNF-α、IL-6和CRP用高敏酶联免疫吸附（Enzyme-LinkedImmunosorbentAssay,ELISA）法测定,仪器为BIO-RADModel680型酶标仪（美国）；皮质醇用电化学发光免疫法测定,仪器为FMQ-9013C型γ放免分析仪.
1.10淋巴细胞培养
为检测上述血清各参数对于淋巴细胞凋亡的影响,取健康、无运动经历的青年男性受试者的全血5mL并分离淋巴细胞.将淋巴细胞与受试者HST训练前的血清以及训练后3h的血清共培养24h,血清浓度均为50%.为检验不同血清介质对淋巴细胞凋亡的作用,将细胞在加入介质的培养基（RPMI1640）中培养24h,介质分别为L-乳酸（16mmol/L）、重组IL-6（recombinantIL-6,rIL-6）（25pg/mL）、rCRP（4μg/mL）以及皮质醇（30μg/mL）,相应浓度为HST后3h的最高值.为探讨皮质醇的作用,将淋巴细胞与加入MIF（GC受体阻断剂）的HST血清共孵育.用流式细胞仪（Beckman,德国）检测淋巴细胞凋亡率.
1.11统计学处理
所有数据均用SPSS20.0统计软件进行统计学分析处理,结果用“平均数&plun;标准差”表示.同一时间点不同强度训练（HSTvs.MST）比较使用独立样本t检验；同一强度训练不同时间点（训练前、训练后3h和训练后24h）比较使用重复测量方差分析,多重比较使用LSD检验；使用Pearson相关对变量之间的关联性进行分析.P<0.05为具有统计学差异.
2结果
2.11RM测试结果以及不同强度力量训练的生理反应
1RM测试结果与HST每组训练重复次数见表1.1RM测试结果与肌肉体积密切相关,肱三头肌（肩部下拉）力量最小,而股四头肌（腿屈伸）力量最大.HST时每组训练重复次数从8.2（肩部推举,三角肌）~15.2（腿屈伸,股四头肌）.
HST和MST后HR和La均较训练前明显升高（P<0.05）,HST训练后HR和La均高于MST（P<0.05）（见表2）.
HST和MST后3h白细胞和粒细胞计数显著增多（P<0.05）,HST白细胞计数和粒细胞高于MST（P<0.05）,训练后24h均恢复至训练前水平（P>0.05）,因此白细胞增多主要是粒细胞增加造成的.HST后3h淋巴细胞减少（P<0.05）,训练后24h恢复（P>0.05）；MST后淋巴细胞无显著性变化（P>0.05）（见表3）.
2.2淋巴细胞凋亡及相关标志物的变化
HST后3h淋巴细胞凋亡率（Annexin-V阳性）显著升高（P<0.05）,24h恢复至训练前水平（P>0.05）；HST后3hMMP显著降低,（P<0.05）,24h恢复（P>0.05）.MST后淋巴细胞凋亡率和MMP均无显著性变化（P>0.05）.淋巴细胞坏死率（PI阳性）在HST和MST后均无显著性变化（P>0.05）（见图1~图3）.
凋亡相关表面标志物中,CD95阳性细胞（Fas受体）在HST后3h显著升高（P<0.05）,而CD95配体（Fas配体）无显著性变化（P>0.05）.MST后死亡受体（CD95和CD95配体）的表达均无显著性变化（P>0.05）.淋巴细胞激活标志物CD69在HST和MST后均无显著性变化（P>0.05）（见图4~图6）.
HST后3h淋巴细胞Bcl-2蛋白含量显著降低（P<0.05）并一直持续至训练后24h（P<0.05）.MST后Bcl-2蛋白含量无显著性变化（P>0.05）（见图7）.
2.3炎症因子和激素的变化
HST后3hIL-6、CRP和皮质醇显著性增高（P<0.05）,TNF-α无显著性变化（P>0.05）；MST后各指标均无显著性变化（P>0.05）.HST后3h血清皮质醇含量与淋巴细胞凋亡率显著正相关（r＝0.69,P<0.05）（见表4）.
2.4体外淋巴细胞与血清介质共培养后淋巴细胞凋亡率的变化
HST后3h血清与淋巴细胞共培养后淋巴细胞凋亡率明显高于训练前血清（P<0.05）.将淋巴细胞与单一血清介质进行共培养,其中L-乳酸、rIL-6和rCRP对淋巴细胞凋亡率均无显著性影响（P>0.05）,皮质醇则明显提高淋巴细胞凋亡率（P<0.05）,在训练后3h血清中加入MIF则显著降低淋巴细胞凋亡率（P<0.05）（见图8）.
3讨论
本研究发现,高强度力量训练后淋巴细胞凋亡明显增加,同时伴MMP降低,Bcl-2表达下调,CD95（Fas受体）表达上调.尽管HST后乳酸明显升高并出现轻度炎症反应,但血清皮质醇可能是诱导淋巴细胞凋亡的主要介质（因子）.这一推论在离体实验中得到证实,即淋巴细胞与皮质醇共培养可造成细胞凋亡率增加,而HST后血清用GC受体拮抗剂MIF预处理后再与淋巴细胞共培养可减少细胞凋亡.此外,相关分析进一步证实皮质醇的效应,即HST后3h血清皮质醇含量与淋巴细胞凋亡率显著正相关（r＝0.69）.
本研究证实了先前的假设,即中等强度力量训练并未诱导淋巴细胞凋亡,而高强度力量训练后淋巴细胞凋亡率明显增加,同时伴MMP降低以及CD95表达上调,提示力量训练诱导的细胞凋亡存在运动强度依赖性,这与前人针对耐力训练的研究结果一致[19]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}225.Mooren等[20]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}230的研究同样证实,马拉松跑后CD69和CD95表达增加,提示剧烈运动产生激活诱导性细胞死亡（activation-inducedcelldeath）效应.但由于CD69表达无显著性变化,因此本研究并未观察到淋巴细胞激活,可能与受试对象、运动方式、运动时间、运动强度以及取血时机等因素有关.
Bcl-2作为抗凋亡蛋白分布于细胞内膜,其主要作用在于通过抑制凋亡前体蛋白如细胞色素C等释放入胞浆,继而维持线粒体的完整性[21]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}231.在本研究中,HST后3hBcl-2表达量显著下降并持续至HST后24h,而此时淋巴细胞凋亡率和MMP均恢复至安静时水平,因此我们推测,Bcl-2下调在时序上应早于MMP降低,即Bcl-2下调是MMP降低的原因.研究也证实,Bcl-2下调增加细胞凋亡敏感性,然而Bcl-2本身并不能诱导凋亡,需要其他因子参与.运动对淋巴细胞Bcl-2表达量的调节在Ferrer等[21]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}231的研究中亦得到证实,但具体机制尚未明确.已证实,运动诱导自由基增多导致的氧化应激状态可下调Bcl-2表达[21]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}231.由于高强度力量训练同样可诱导自由基增加,因此氧化应激可能是本研究中HST后3h和24hBcl-2表达持续下降的主要原因.
为验证HST后的血清介质是否可诱导淋巴细胞凋亡,本研究进一步进行体外实验,结果发现,HST后3h血清与淋巴细胞共培养后淋巴细胞凋亡率明显高于训练前血清与淋巴细胞共培养,提示血清中某些介质可诱导淋巴细胞凋亡.为探寻诱导淋巴细胞凋亡的确切血清介质,将淋巴细胞与单一血清介质（分别为L-乳酸、rIL-6、rCRP和皮质醇）进行共培养.由于乳酸可作为信号分子诱导巨噬细胞中炎症因子表达上调,而且酸中毒也是淋巴细胞凋亡的诱因之一,因此本研究利用L-乳酸与淋巴细胞共培养,结果却未发现细胞凋亡增加.这一结果在Mooren等[22]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}232的研究中也得到了证实,即马拉松跑后乳酸轻度增加而淋巴细胞凋亡率却未明显升高.此外,本研究还发现,体外炎症因子rIL-6和rCRP对淋巴细胞凋亡率均无显著性影响.在Neubauer等[23]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}233和Reichhold等[24]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}234的研究中,CRP和IL-6与淋巴细胞凋亡率并无显著性关联.仅有一项研究报道[23]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}233,铁人三项运动员运动后即刻IL-6含量与坏死细胞数量显著正相关.本研究中,PI标记的淋巴细胞坏死率在不同强度力量训练后均无显著性变化,由此推测,在Neubauer等[23]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}233的实验中,由于运动后IL-6升高了50倍（本研究约升高7倍）,淋巴细胞不仅发生凋亡且部分细胞可能发生坏死.
Kraemer等[25]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}235发现,高强度力量训练后皮质醇含量显著增加.研究认为,皮质醇增加通过影响淋巴细胞迁移方式或诱导其凋亡从而导致运动后淋巴细胞数量减少（即淋巴细胞减少症）[26]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}240.本研究证实,皮质醇在诱导淋巴细胞凋亡中起主要作用.将HST后3h浓度相当的皮质醇单独与健康淋巴细胞共培养后细胞凋亡率明显增加,而在HST后3h血清中加入MIF则显著降低淋巴细胞凋亡,提示GC受体可能是细胞凋亡通路中的重要信号分子,皮质醇诱导淋巴细胞凋亡是通过GC受体介导和实现的.GC受体激活前与热休克蛋白90（heatshockprotein90,HSP90）相连接,当与其配体结合时,HSP90与GC受体分离,受体－激素复合物转移进入细胞核并反式激活包括凋亡基因在内的多种基因,进而促进其表达（转录和翻译）[27]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}239.因此,GC诱导细胞凋亡并非直接通过经典的外源性或内源性凋亡途径介导.然而,CD95表达上调同时细胞凋亡增加,提示外源性细胞凋亡途径被激活.Schmidt等[28]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}236证实在单核细胞中存在GC诱导的CD95依赖性凋亡途径.然而运动中上述信号途径的相互作用尚不清楚.本研究结果显示,Bcl-2下调与皮质醇诱导的细胞凋亡存在关联.有研究证实[29-30]ADDINKYMRREF{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}237,{A1B87CEC-871D-4DCF-ADCA-37F27FFA21B1}238,Bcl-2过表达能够抑制GC诱导的细胞凋亡作用,Bcl-2缺失小鼠出现暴发性淋巴细胞凋亡,用GC处理后则加速细胞死亡.结合本研究结果我们认为,高强度运动时,Bcl-2水平决定了GC诱导细胞凋亡的敏感性.
4结论
力量训练诱导淋巴细胞凋亡存在运动强度依赖性,皮质醇经由糖皮质激素受体介导的信号转导通路可能参与了高强度力量训练诱导淋巴细胞凋亡的病理生理过程.
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