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HPLC法测定阿加曲班中的有关物质
摘 要：目的建立高效液相色谱法测定阿加曲班中有关物质的方法.方法采用Agela Innoval NH2 色谱柱（4.6mm*250mm,5μm）,流动相为乙腈-水（90：10）；检测波长为254nm,柱温为45℃,进样体积：20μl,流速为1.0mL/min.结果显示阿加曲班及各杂质能得到良好的分离,３批样品中单一杂质的含量质量分数均小于0.1%.该方法可用于阿加曲班原料药中有关物质的检测
关键词：高效液相色谱法；阿加曲班；有关物质
阿加曲班是化学合成的低分子药物,是精氨酸的衍生物.阿加曲班直接与凝血酶的催化活性位点（包括丝氨酸-组氨酸-精氨酸结构）结合,灭活凝血酶.由于阿加曲班分子量小,它能进入到血栓内部,直接灭活已经与纤维蛋白结合的凝血酶[1].其化学名称（2R,4R）-4--1-[N-[（3--1,2,3,4-四氢-8-喹啉基）磺酰]-L-精氨酰]-2-哌啶甲酸一水合物[2],分子式C23H36N6O5S·H2O,分子量为527.
根据合成工艺,本品可能存在多个主要有关物质,分别为杂质1,杂质2.目前阿加曲班的JPXVII 标准中有关物质方法2 采用TLC 法对杂质1、2 进行检测,考虑到TLC 方法的灵敏度,为有效地控制阿加曲班原料药中有关物质,保证其质量,参照药品杂质分析指导原则[3]规定本文作者并采用主成分自身对照法测定上述2 种已知杂质以及其他未知有关物质.所建立方法快速、准确、专属性强、重现性好.
1 仪器和试药
1.1 仪器 Agilent1260 型高效液相色谱仪,色谱数据工作站均由美国Agilent 公司提供,色谱柱Agela Innoval NH2 色谱柱（4.6mm*250mm,5μm）,EX125ZH 电子天平（奥豪斯仪器）.
1.2 试药 阿加曲班（江苏悦兴医药技术有限公司小试实验室,批号20170501、20170502、20170503）,杂质1 对照品（江苏悦兴医药技术有限公司,批号：20170301,纯度：98.9%）,杂质2 对照品（江苏悦兴医药技术有限公司,批号：20170306,纯度：99.1%）,乙腈（色谱级,美国J.T.Baker）,蒸馏水.
2 方法
2.1 色谱条件： 色谱柱： Agela Innoval NH2 色谱柱（4.6mm*250mm,5μm）,流动相为乙腈-水（90：10）；检测波长为254nm,柱温为45℃,进样体积：20μl,流速为1.0mL/min.2.2 溶液配制
2.2.1 对照溶液：精密量取适量,用流动相定量稀释制成每1ml 中含5μg 的溶液,作为对照溶液.
2.2.2 供试品溶液：取本品10mg,精密称定,置10ml 量瓶中,加流动相溶解并定量稀释至刻度,摇匀,作为供试品溶液.2.2.3 系统适用性溶液：取阿加曲班对照品5mg、杂质B 对照品2mg,精密称定,置50ml 量瓶中,流动相溶解并定量稀释至刻度,摇匀,精密量取20μl 注入高效液相色谱仪,记录色谱图,出峰顺序为阿加曲班、阿加曲班杂质B,相邻峰的分离度应大于1.5,理论板数按阿加曲班峰计算不低于2000
2.3 方法验证
2.3.1 专属性考察：取本品约10mg,精密称定,置10ml 量瓶中,加乙腈1ml 溶解,分别进行酸、碱、氧化、光、热破坏后进样20μL, 记录色谱图.观察各强制破坏溶液主峰纯度及主峰前后杂质分离情况.结果本品在酸、碱、氧化、高温、光照条件下均有降解杂质生成,其中碱性条件下的降解产物较明显,所选色谱条件均能将主峰、已知杂质峰与相邻杂质峰实现较好的分离（R＞1.5）,说明本法专属性好.
2.3.2 检测限 取阿加曲班工作对照品、杂质1、杂质2 适量,加流动相逐级稀释至适宜浓度,在上述色谱条件下,以3 倍信噪比作为检测限.结论：阿加曲班检测限0.5ng,杂质1 检测限为0.8ng,杂质2 检测限为0.25ng.阿加曲班检查浓度为1mg/mL,检测限为0.5ng,杂质在0.003%以上可检出,杂质1、杂质2检测限即相当于主成分的0.004%、0.001%,表明本品色谱条件灵敏度高,适合进行杂质控制.
2.3.3 线性 精密量取各对照品贮备液适量,加流动相稀释成浓度为每1ml 中含阿加曲班约0.1μg、0.5μg、1μg、10μg、100μg、1000μg 的溶液.含杂质1 分别为0.04μg、0.16μg、0.4μg、1.6μg、8μg、16μg 的溶液.含杂质2 分别为0.5μg、1μg、5μg、10μg、100μg、1000μg 的溶液.进样记录色谱图.计算浓度与峰面积的线性关系.结论：阿加曲班的相关系数r等于0.9999,说明在0.1μg/ml～1000μg/ml 浓度范围内线性关系良好.杂质1 的相关系数r等于,0.9999,在0.04μg/ml～16μg/ml 浓度范围内,具有良好的线性关系,杂质2 的相关系数r等于1,在0.5μg/ml～1000μg/ml浓度范围内,具有良好的线性关系.
2.3.4 重复性 取样品适量,按照测定方法平行配制样品6份,考察其中的杂质1 和杂质2,进样记录色谱图.结果6 份供试品溶液均未检出杂质1 及杂质2,说明本方法精密度良好.
2.4 样品测定 用上述方法对阿加曲班（批号20170501、20170502、20170503）进行检测,结果杂质1 及杂质2 均未检出,能符合要求（≤0.1%）
3 讨论
日本药典2017 中使用的TLC（薄层色谱法）的方法对上述杂质进行控制,灵敏度较低,不能有效的对阿加曲班原料中的有关物质进行合理的控制,改用HPLC 法后,杂质1、杂质2检测限相当于主成分的0.004%、0.001%,能狗有效的控制产品质量,保证患者的安全用药.
本试验所建立的方法简便、准确,线性范围宽,重现性好,特异性高可满品质量研究的要求,为其药品研发与仿制的质量控制提供了可靠的依据.
参考文献：
[1]张子彦,张宏卫等.阿加曲班研究进展.国际内科学杂志[J],2007,34（8）：483-485.
[2]袁莉娟,刘爱民,刘蕾等.新型凝血酶抑制剂阿加曲班,中国新药杂志[J],2005,14（2）：230-234.
[3]国家药典委员会．中华人民共和国药典：四部[M]．北京：中国医药科技出版社,2015：377-378．
作者简介：
1.姓名（出生年、性别）：尹富仕 1985,男,籍贯：湖南长沙,职称和学历：中级职称,硕士研究生,研究方向或专业：生物化学与分子生物学
2.姓名（出生年、性别）：王迎波 1982,女,籍贯：河北保定,职称和学历：中级职称,硕士研究生,研究方向或专业：生物化学与分子生物学
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