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植物基因组DNA提取方法综述
丁丽艳1,何宝国2,刘 宇3,宋 斌1,李 伟1,周 莉2,朱巍巍4
（1．黑龙江省畜牧研究所,黑龙江齐齐哈尔161005；2．齐齐哈尔医学院,黑龙江齐齐哈尔161042；
3．黑龙江省兽医科学研究所,黑龙江齐齐哈尔161000；4．齐齐哈尔大学,黑龙江齐齐哈尔161000）摘 要：本文介绍植物基因组DNA提取原理、植物组织的取材及保存.DNA提取和纯度检测的方法,分析了根据采集条件、植物生长发育时期和试验条件等的不同,采用不同的植物组织取材和保存方法；根据研究目的、研究对象等的不同,采取不同的DNA提取方法,表明了要提取高纯度的植物基因组DNA,必须从植物组织的采集、保存、预处理和基因提取过程等环节严格加强操作,确保下一步试验顺利进行.
关键词：植物；DNA;提取；纯化；影响因素
中图分类号：Q7 81
文献标识码：A
文章编号：2095-9737(2017)08-0006-03
基因组DNA的提取和纯化是植物分子生物学和遗传育种学的基础及关键环节.随着基因工程等分子生物技术的快速发展及广泛应用,人们经常需要提取高分子量的植物DNA,用于构建基因文库、基因组southern分析、酶切及克隆等,根据植物的研究对象、研究目的和研究成本等的不同,提取基因组DNA所应用的方法也不同,植物基因组DNA的提取率决定于材料的选择、提取操作过程等因素,现就植物基因组DNA的提取原理、植物取材、提取DNA的方法、纯度检测及影响因素等方面进行综述,以期作为参考.
1 提取原理
采用机械研磨的方法在液氮中磨碎植物的组织和细胞,通过液氮对样品进行急冻,使样品变硬、变脆,这样可以保证研磨的时候能够充分、均匀、DNA释放更充分,同时提供一个相对低温的环境,以保证样品DNA的稳定性.
植物细胞匀浆含有多种酶类,影响着DNA的提取和纯化,在提取缓冲液中需加入抗氧化剂或强还原剂以降低这些酶类的活性,并减少研磨过程中各种酶类的作用.
细胞中的DNA绝大多数以DNA-蛋白复合物(DNP)的形式存在于细胞核内.提取DNA时,一般先破碎细胞释放出DNP,再用含少量异戊醇的氯仿除去蛋白质,最后用乙醇把DNA从抽提液中沉淀出来.DNP与核糖核蛋白(RNP)在不同浓度的电解质溶液中溶解度差别很大,利用这一特性可将二者分离.
十二烷基肌酸钠( sarkosyl)、十六烷基三溴化铵(hexadyltrimethyl ammomum bromide,CTAB),十二烷基硫酸钠( sodium dodecyl sulfate,SDS)等离子型表面活性剂,能溶解细胞膜和核膜蛋白,使核蛋白解聚,将DNA游离出来.再加入苯酚和氯仿等有机溶剂,使蛋白质变性,并使抽提液分相,因核酸(DNA、RNA)水溶性很强,经离心后即可从抽提液中除去细胞碎片和大部分蛋白质,上清液中加入无水乙醇使DNA沉淀,沉淀DNA溶于TE溶液中,获得总基因组DNA溶液：1].
2 植物组织取材及保存方法
植物的组织取材与保存方法对植物基因组DNA的提取 效果影响较大.应尽可能地选取新鲜、多汁的幼嫩组织材料.但根据采集条件、植物生长发育时期和试验条件的不同,对植物组织采用不同的取材和保存方式,以尽量达到提取的基因更纯,杂质更少,更利于试验的正常开展.
2.1 鲜嫩多汁材料
采集的过程中应尽可能使组织材料保持水分,在取样后立即用浸湿的纱布包裹,放置在密闭的冰盒中,这样可使组织材料3～5天仍然保持新鲜.
2.2野外近距离采集生长期比较长的新鲜叶片
将生长期较长的新鲜叶片采集下来,运回实验室后,在黑暗条件下放置1～2天,以消耗淀粉和其他多糖,利于提取的DNA基因更纯.
2.3野外远距离采集生长期比较长的新鲜叶片
将采集下来的叶片放置于液氮中进行冷冻保存或用盛有无水Caso4的瓶子保存,使其迅速干燥（这种方法可将材料保存数月）,运回试验室后应尽快提取植物DNA.
2.4 需要长期保存的植物材料
当暂时实验条件不充分时,植物材料采集后,投入液氮中冷冻后,返回实验室后取出直接放入超低温冰箱（- 80℃）中保存,此方法可长期保存.但是,在提取基因组DNA时,应防止材料在空气中融化（否则酚类易被氧化）.
3 植物基因组DNA提取方法
根据研究目的、研究对象和研究成本的不同,植物基因组DNA的提取方法也不同.由于植物组织中含有不同程度的次生代谢产物,如酚类、醌类及丹宁等物质,能够影响DNA的纯化和质量,使DNA降解,抑制PCR反应和酶切效果.依据不同的植物和它的次生代产物的不同,采取不同的基因组DNA提取方法.
3.1 CTAB提取法
此方法多用于禾本科植物基因组DNA的提取.此方法是1987年Doyle最先应用Ⅲ.
植物组织在液氮中磨碎,转移至65℃水浴提取液中 30 min.室温下冷却至40℃,向上清液中加入CTAB液,再 用氯仿一异戊醇提取1次,去除核酸溶液中的痕量酚.抽提 液中再加入异丙醇,室温下放置1 h,离心,取沉淀物再用 76%乙醇浸泡30 min,然后离心10 min,风干DNA后,溶于TE中-20℃保存并备用.
后来应用改进的CTAB法,即用特定吸附作用的螯合树脂在特定条件下,吸附、纯化DNA.首先粗提DNA,以除去大多不可溶的杂质,然后调节DNA上清液酸度达7.0,使DNA与阴离子交换树脂特异性地结合,然后处理和洗脱含有DNA的交换树脂柱,收集纯化的DNA,改进的CTAB法适用范围广,适用效果较好‘3].
3.2 PVP提取法
此方法主要应用于林木类植物DNA的提取.1997年Kim最先应用此方法提取果树和针叶类林木中高质量的DNA.
植物组织在液氮中磨碎,转移到提取液中,加入巯基乙醇,然后室温下放置th后,加入PVP和醋酸铵溶液混匀后冰浴30 min,PVP可以有效去除多酚和多糖,冰浴下促进核酸分离纯化.4℃下离心15 min,将上清液取出,加入异丙醇,在-20℃下沉淀DNA 30 min,然后4℃离心,弃去上清液,再用80%乙醇沉淀DNA,最后将收集的DNA溶于TE中-20℃保存并备用.
3.3 SDS提取法
此方法适用于多种植物DNA的提取.
将植物组织在液氮中磨碎,转移到SDS裂解液中,然后加入醋酸钾,冰浴30 min,再离心20 min,弃去沉淀并过滤上清液,将含有DNA的上清液加人阴离子柱上,提取DNA后,再用70%乙醇漂洗,风干后,将纯化的DNA溶于TE中-20℃保存并备用.
3.4尿素提取法
此方法适用于一般植物和真核微生物DNA的提取.Dudler 1990年最先应用此方法.
植物组织在液氮中磨碎,转移到提取液中,加入苯酚,充分混匀,再加入氯仿,4℃下离心15 min,然后将上清液中加入核酸酶,37℃下放置th,再用苯酚一氯仿提取2次后,将含DNA的上清液加入异丙醇,离心10 min,取沉淀用乙醇洗涤,然后离心弃去上清液,沉淀风干后溶于TE中-20℃下保存待用.
4 植物基因组DNA纯度检测
4.1 琼脂糖凝胶电泳检测法
4.1.1制备琼脂糖凝胶
按照提取的DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的浓度.一般DNA长度越长,凝胶琼脂糖的浓度越小(0.5%～2.0%).称取一定量的琼脂糖,放人锥形瓶中,加入一定体积的5×TBE,置微波炉中完全熔化.
4.1.2 胶板的制备
取有机玻璃内槽洗净、晾干后置于水平位置,放好样品梳子.将冷却到60℃左右的琼脂糖凝胶液缓缓倒入有机玻璃内槽,形成均匀的胶面.待胶凝固后,取出梳子,将槽放在电泳槽中.加入缓冲液至高于胶面0.5 cm.
4.1.3加样
用移液将DNA样品溶液（9μL）和上样缓冲液（2μL）混合后,加入加样孔中.
4.1.4 电泳
接通电泳槽与电泳仪的电源.最高电压不超过5V／cm.当溴酚蓝染料移到胶面2 cm处,停止电泳.
4.1.5染色
将电泳后的凝胶浸入EB液中,染色10 min后在紫外透射仪中观察凝胶中的带.
如果DNA主条带清晰,表明提取物完整性较好,反之则差；如果DNA主带亮度较亮,则表明DNA浓度较高,反之则较低.
4.2 紫外分光光度计法
紫外分光光度计法只能用于测定浓度大于0. 25μg/mL的核酸溶液.
4.2.1仪器校零
分光光度计先用蒸馏水在260 nm和280 nm两个波长下校零.
4.2.2加样
取DNA样品2μL,用水稀释100倍,转入分光光度计的石英比色杯中.
4.2.3读数
在260 nm和280 nm分别读出样品光密度值.OD260和OD280的比值在1.7～1.9之间,说明提纯度较好,低于1.7,说明提取的DNA中残留有较多的蛋白质,可用酚、氯仿继续抽提；若大于2．O,说明有RNA污染或DNA链断裂.提取的DNA量可用下式计算：P- cV(c为DNA浓度,μg/mL;V为提取的DNA溶液的体积,mL).
4.3 荧光PCR扩增检测法
荧光PCR扩增检测法即在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化对PCR过程实时监控,最后通过Ct值和标准曲线对未知模板进行定量分析的方法.该方法分为染料法和探针法.荧光分光光度法可检测浓度小于0. 25 μg/mL的核酸溶液.
4.3.1 染料法（SYBR Green法）
染料法荧光定量PCR是利用SYBR Green分子产生的荧光信号来进行样品定量,SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链中,发出荧光信号,而没有掺入的SYBR染料则不能发出荧光,因此可以使荧光信号的增加与PCR产物的增加达到同步化.此方法与常规PCR相似,只是在反应体系中加入SYBR Green染料分子,该染料分子的激发波长为497 nm,发射波长为520 nm.与EB的性能相似,SYBRGreen处于游离状态时具有很低的荧光,当反应体系中存在DNA时,SYBR Green能特异性的与之结合并在497 nm下激发荧光.
此方法的优点是使用方便、灵活.缺点是容易与非特异性双链DNA结合,产生假阳性；同时,对引物的设计及实验条件的优化要求很高,而且不能做多重检测.
4.3.2探针法
探针法即除了引物外另外设置一个探针,在探针的两端分别带上发光集团和淬灭集团,这个时候两个平衡不发光,但是当DNA通过引物合成的时候,探针被折断,释放出发光集团和淬灭集团,两个距离较远,发光集团产生荧光,被机器收集到信号,从而检测基因的量.探针法荧光定量PCR与常规PCR相比,在上、下游引物之外还加入了具有序列特异性的、具有荧光标记的探针,该探针具有特异性,只能与待检测序列结合,目前最常用的是TaqMan探针.
此方法的优点是：能够预测和提前进行反应条件的优化,可做多重检测.缺点是此方法需要合成探针,成本较高.
5 植物基因组DNA提取纯度的影响因素
5.1 材料的选择
健康、新鲜、细嫩的植物叶片细胞正处于分裂期,含有较多完整的DNA,并且代谢物较少,是理想的植物DNA提取材料.而成熟或老化的叶片组织含有较多的多糖、多酚等代谢产物,会使DNA的提取纯度降低.
5.2 材料的预处理
材料的预处理大大影响基因提取的纯度.将采集下来的叶片在黑暗条件下放置1～2天,消耗淀粉和其他多糖,同时,用70%乙醇清洗浸泡,再用灭菌去离子水冲洗干净,这样可以除去外源DNA,经过这些处理后再提取基因组DNA,其含量会更纯¨].
5.3 基因组DNA提取过程
5.3.1研磨过程
研磨的方法和速度等因素对基因组DNA提取的纯度影响较大.要将材料放入液氮中快速研磨,这样可以防止DNA降解,同时防止材料溅出,使提取的DNA含量和纯度更高.
5.3.2水浴过程
水浴过程中,采用摇晃混匀法,不能采用机械振荡方式,以免力量过大使DNA断裂,影响DNA提取的质量.
5.3.3离心过程
随着DNA提取的进一步操作,离心的转数和时间应逐渐缩短,避免离心过程对DNA键的断裂,以获得高纯度的DNA.
5.3.4提取中试剂的添加
5.3.4.1 氯仿／异戊醇的添加
添加氯仿／异戊醇是为了除去蛋白质,适当增加其用量和次数,可以进一步提高DNA的纯度,通常连续3次添加该试剂后,提取DNA的纯度更高.
5.3.4.2 乙醇的添加
一般添加1倍用量的乙醇沉淀核酸效果较好,如果量增加,则有共沉淀形成,与DNA形成混合物,很难去除,并且在添加乙醇时,沿着离心管壁倒入,这样可以达到充分沉淀的目的.
5.3.4.3 Tris饱和苯酚的添加
在水浴加热时,直接加入Tris饱和苯酚,能够加强其对蛋白质等杂质的变性能力,更利于去除蛋白质.
5.4 基因组DNA提取条件
5.4.1温度
基因提取过程中,如果温度过高（超过15℃）,会使DNA断裂.因此提取过程应尽量在低温下进行,在夏季高温时操作过程中,可应用冰浴条件下提取DNA.
5.4.2材料的干燥程度
不同干燥程度和方法对提取DNA的效果有一定的影响.用新鲜的叶片提取DNA质量较好,无降解现象发生；硅胶干燥的叶片提取的DNA基本没有降解；室温下自然干燥后提取的DNA,玉米材料时降解率较高,草类植物降解率不高；用烘箱烘干法,温度越高,DNA降解率也越高,其中45℃下效果较好.
5.4.3机械力度
机械力度对提取DNA的效果影响也较大,力度越大,DNA断裂率越高.因此在提取过程中应尽力避免多次溶液转移和剧烈震荡,操作时力度要轻缓、柔和.
5.5质量检测过程的影响
5.5.1溶液pH值
应用分光光度计法检测DNA时,溶液pH值为7.4时,测得的OD值最大.溶液pH值偏离7.4越远,测得的DNA含量越低.因此选择提取液和TE缓冲液时,使用前用pH试纸测试一下,尽量将其pH值调至7.4.
5.5.2电泳缓冲液
应用凝胶电泳检测法时,电泳缓冲液多次使用后,离子强度降低,pH值变大,缓冲能力下降,测得DNA条带不清晰,所以应用凝胶法检测DNA时,电泳缓冲液最好现用现配.
5.5.3 DNA加样量
应用凝胶电泳检测法时,DNA加样量影响着DNA条带的清晰度,过多过少都不清晰.一般每次加样量不少于5μL,不高于10 μL,效果较好.
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