毕业论文网
这是一篇与生物传感器论文范文相关的免费优秀学术论文范文资料,为你的论文写作提供参考。
生物传感器测定农药类污染物2，4-D的检测方法
摘 要：平面波导型荧光免疫传感器(PWFI)是一种基于全内反射荧光和免疫分析原理的具有高灵敏度的生物传感器.本研究基于PWFI传感器,利用间接免疫反应原理,实现了对农药类小分子污染物2,4-D的检测,建立了运用PWFI传感器测定农药类小分子污染物的检测方法.为水环境保护和突发性污染事故应急监测等提供快速、简便、有效的技术支持.
关键词：生物传感器；检测；污染物；农药
Abstract: The Planar Weguide Florescence Immuno-sensor (PWFD is a kind ofhigh sensitive bio-sensorwhich based on the principles ofTotal Internal Reflection Fluorescence and Immunoassay. This paper introducesto establish a detection method of all molecules pesticide pollutant-2,4-D by using PWFI bio-sensor. Thiethod can be used to the rapid detection and early warning ofpesticide pollutions as a support to the protectionofwater environment,
农药在人类的农业生产中为防治病虫草害发挥了重要的作用,但也带来了环境污染问题.农药是化学药品中毒性较高,降解缓慢的物质,经过长期积累、富集、迁移、转化,在大气、水体、食物链等介质中扩散传递,使环境空气、环境水体、环境土壤和食物都受到不同程度的污染,危害人类健康.何光好于1998年对全国109,700km河流进行的评价结果表明有70.6%的河流受到农药的污染lll.大量研究结果显示,长江、黄河、湖泊、水库、海域等水体中均检出有毒有机污染物质,有毒有机物引起的水环境污染问题已成为世界普遍关注的环境问题.
常用的微量有毒有机污染物检测技术主要有：气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、气液相质谱联用(GC-MC)等,这些技术能灵敏准确地检测各种不同环境样品中的有机污染物,但由于所用的仪器昂贵,使用环境要求较高,操作技术复杂,须由专业技术人员运行管理,维护成本高等,广泛普及应用于一般环境监测机构还有很大的局限性.另外,在检测过程中要求对样品进行复杂的预处理,耗时长,时效性差,不能满足环境污染事件现场应急监测的工作需要.生物传感器是一类基于生物分子与污染物的特异性反应对污染物进行识别,并通过光学或电化学方法获取信号的检测系统.近年,生物传感器的快速发展为其应用于环境中微量有毒有机物的检测展示了广阔的前景.本文介绍了基于平面物波导荧光免疫生物传感器测定农药类污染物-2,4-D的检测方法研究.
1实验仪器与材料
本研究采用了清华大学环境学院研发的平面波导型荧光免疫传感器系统,如图1所示.平面波导型荧光免疫传感器系统由光路系统、流动进样系统、信号处理系统三部分组成.其中,光路系统主要包括激发光路和荧光收集光路；流动进样与反应系统主要包括免疫芯片、反应池、进样阀和微量计量泵；信号处理系统主要包括控制电路和信号处理电路.
试验材料包括：修饰后具有特异性反应点位的免疫芯片.Cy5.5标记的2,4-D抗体（研究组自备）,抗体稀释液（研究组自备）,2,4-等于氯苯氧乙酸使用原液(2,4-D,Aldrich) （研究组自备）,lOmmol/L的PBS缓冲溶液,pH等于1.9,浓度0.5%的SDS活化试剂,磷酸（H04,分析纯）,氯化钠（NaCl,分析纯）,氯酸钾（KC1,分析纯）,磷酸二氢钾（KH2P04,分析纯）,磷酸氢二钠(Na2HP04 12H20,分析纯),超纯水. （注：所用试剂除购自Sigma的试剂外,其余试剂均为国内生产的分析纯试剂）.
2免疫芯片的修饰
检测的核心元件是对2,4-D具有特异性免疫反应的生物芯片.因此,首先要对玻璃传感基片进行清洗和表面羟基化,然后将基片浸入2%的3．巯基丙基三甲氧基硅烷(MTS)溶液,在基片表面引入巯基,将巯基化的基片用无水甲醇清洗,吹干备用.将巯基化的基片浸没在0.002mol/L的N-琥珀酰胺基-4-马来酰胺一丁酸脂(GMBS)双功能试剂中（GMBS可与巯基和氨基发生反应）,双功能试剂与基片表面结合,然后将15 ul的2,4-D复合抗原溶液滴加于基片表面的检测点位上,在4c冰箱内放置过夜以保证反应完全,经过反应形成对2,4-D具有特异性吸附的检测芯片.为了降低非特异性吸附对2,4-D检测的干扰,需要对芯片产生非特异性吸附的表面进行封闭.将清洗干净的上述芯片浸没于2mg/mLIYJBSA溶液中60rrun,反应完全后用高纯水冲洗干净,用氮气吹干.最后,在芯片垂直切面的一段0.5cm处涂上一薄层黑漆以吸收剩余的激发光.至此,2,4-D检测生物芯片制备完成.
3数据分析方法
用平面波导型荧光免疫传感器检测农药类污染物2,4-D的方法,是建立在间接竞争模式基础上的,在本研究中,先将小分子配基固定到传感芯片上,然后将经荧光标记的抗体和待测样品中的抗原经过进样系统定量混合,使混合溶液预先预反应一段时间后,再将其通过进样系统输送到反应池进行反应,此时混合样品中剩余的带有荧光标记的抗体再与固定在传感芯片上的抗原结合,测定系统响应信号.在这种检测模式下,待测样品中的抗原越多,反应后剩余荧光标记抗体就会越少,能与固定传感芯片上的抗原结合的荧光标记抗体也就越少,系统的检测响应信号就越弱,反之信号就越强,两者间呈负相关系.标准曲线是进行数据分析的基础,也是实现定量关系的主要依据．同时也是验证检测方法的灵敏度的主要依据.在本研究中标准曲线是指描述检测信号值与抗原浓度的关系曲线,也称为剂量一效应曲线,检测方法的关键是在以上优化检测条件下,能够制作具有重复性的标准曲线,用以验证检测方法的灵敏性、准确性和重现性.
基于平面波导型荧光免疫传感器检测农药类污染物2,4-D的方法是建立在间接竞争模式基础上的,所以标准曲线是在半对数坐标体系下的反S型曲线,通常可用四参数的数学函数模型即Logistic模型模拟,可具有很好的效果.
限,它能准确反映出分析方法能定量测定低浓度水平待测物质的极限可能性,本研究方法定义系统检测响应信号最大值的95%对应的浓度值x3为检测方法的检测下限.
Ic50值：定义系统检测响应信号最大值的50%对应的浓度值x0为检测方法的Ic50值,亦称检测方法的半抑制浓度.
为了方便,我们通常将检测数据进行归一化处理后再做成标准曲线,经过归一化处理的标准曲线即可以对不同批次测定出的标准曲线进行比较,也可以用于不同传感芯片绘制的标准曲线进行比较.归一化的标准曲线的纵坐标值用%B/Bo比值的形式表示,意义是测定样品时传感系统的最大有效响应信号值的最大值的比值,且比值在IOO%（当等于A．时,上端渐近线）至O%（等于A2,下端渐近线）之间,公式为：
4实验结果和讨论
4.1标准曲线的测试 标准曲线系列测试结果如图2和图3归一化处理后的仪器检测标准曲线及图4.3标准曲线的模拟参数表所示.
4.2检测周期与重现性测试
我们对平面波导型荧光免疫传感器检测农药类小分子污染物2,4-D的检测条件进行了优化,经过在优化条件下进行标准曲绘制,可以明确经优化的检测条件下检测农药类小分子污染物2,4-D,可以使检测具有快速简便性、高灵敏性、准确性、可靠性等优点.本方法一个完整的检测周期只需15min,比现有的其它仪器分析方法在检测方法上更简便,所用检测周期更短.既可用于实验室分析方法,也可用于野外应急快速检测方法.
为了检验传感芯片的使用期寿命（即芯片的检测使用周期）,在本研究过程中,所有测试过程只使用了一个芯片,经过完成整个研究的测试工作后,芯片使用次数达到200次.为了研究芯片的实际使用寿命,对使用了200个检测周期后的芯片进行了19次重复性和稳定性测试,结果如图4所示.
从图4检测方法的重现性测试可以确定,平面波导型荧光免疫传感器检测农药类小分子污染物2,4-D时,用本研究方法修饰的免疫传感芯片具有多次重复使用的性能,在使用次数超过200次后,传感芯片仍然具有良好的重现性,即稳定性.在该检测条件下重复测试19次,仪器的精密度可以达到2.4%,证明本研究方法研制的免疫传感芯片检测寿命周期大于200次,在实际使用过程中一个传感芯片可以重复使用200次以上,既可以快速简便地进行检测,还可以大大节省检测费用,利于本研究成果在环境监测领域的普及使用.
4,3检测精密度及回收率
加标回收率的测定是在测定样品时,于同一样品的子样中加入一定量的标准物质进行测定,将其测定结果扣除样品的测定值,以计算回收率.加标回收率的测定可以反映测试结果的准确度,当按照平行加标进行回收率测定时,所得结果既可以反映测试结果的准确度,也可以判断其精密度.为了判断利用平面波导型荧光免疫传感器检测农药类小分子污染物2,4-D方法的准确度、精密度及回收率,本研究对实际水样进行了加标回收率测试.
样品加标回收率和计算方法：在测定样品的同时,于同一样品的平行样中加入一定量的标准物质进行测定,将其测定结果扣除样品的测定值,以计算回收率,计算公式如下：
4.4样品的采集
为了对实际水样进行加标测试,验证平面波导型荧光免疫传感器检测农药类小分子污染物2,4-D方法的准确度、精密度及回收率,我们采集清华大学自来水作为饮用水,清华大学近春园水样作为地下水,圆明园水样作为地表水进行了加标回收率测试.样品详细信息如表2所示.
4.5农药类小分子污染物2,4-D实际水样加标回收率的测试与讨论
测试条件：带标记的2,4-D抗体浓度1.2mg/ml;进样时间选择设置上述优化后的进样时间300s（即5min）,预反应时间设置为上述优化时间180s( 3min).
(1)水样的测定：在上述条件下对水样进行设置平行测试3次,记录测试结果.
(2)同一水样分取平行双样,分别加入2,4-D标准溶液,使平行双样中2,4-D浓度分别为1“g/L及2ug/L,对每个加标水样设置平行测试3次,记录测试结果.
实际水样的检测结果及水样加标回收测试结果如表3农药类污染物2,4-D的实际样品测试结果所示.
从表3中可以看出,水样中含2,4-D浓度都低于最低检测限1.9ug/L,可以认为水样中未检出农药类小分子污染物2,4-D.所有水样的加标回收后,加标回收率在88% N111%区间,所有水样检测的变异系数都小于10%,表明基于平面波导型荧光免疫传感器的农药类污染物2,4-D的检测方法具有很好的精密度、准确度及稳定性,可以确定,平面波导型荧光免疫传感器检测农药类小分子污染物2,4-D检测方法是有效可行的.
5结论
为了确保平面波导型荧光免疫传感器对2,4-D的检测方法的准确性和可靠性,在经过优化的检测条件下,对方法的检测性能从检测曲线的绘制、实际样品的测试、实际样品中加标回收率的测试、对使用了200次测试周期的传感免疫芯片进行重复性测试等方面进行了检测方法的性能检验性研究.
1．标准曲线的绘制结果说明,本检测方法传感器系统与2,4-D标准系列浓度间是符合Logistic模型的,模拟的符合程度符合度R2等于0.9967,定量检测区间为9.3～158.6 ug/L;方法的检出限为1.9ug/L；半抑制浓度Ic50值为37.3 u g/L.
2．对测试过200次后的传感芯进行的重复性测试结果表明,传感芯片经过200次以上的周期后,仪器的精密度仍可达到2.4%,表明本方法研制的免疫传感芯片可以重复使用检测200次以上,既可以快速简便地进行检测,还可以大大节省检测费用,利于本研究成果在环境监测领域的普及使用.
3．加标回收率测试结果说明,方法的加标回收率在88%～111%区间,且水样检测的变异系数小于10%,检测方法具有很好的精密度、准确度及稳定性,可以确定,检测方法是有效可行的.
生物传感器论文范文结:
关于本文可作为相关专业生物传感器论文写作研究的大学硕士与本科毕业论文生物传感器论文开题报告范文和职称论文参考文献资料。
1、生物化学论文
2、传感器论文
3、生物技术论文
5、生物科学杂志
6、生物信息学论文