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地塞米松促进猪繁殖和呼吸综合征病毒致病性
王永娟,朱善元,刘博,等. 地塞米松促进猪繁殖与呼吸综合征病毒致病性［J］. 江苏农业科学,2016,44（7）：293-295.
doi：10.15889/j.issn.1002-1302.2016.07.085
地塞米松促进猪繁殖与呼吸综合征病毒致病性
王永娟1, 朱善元1, 刘博1, 崔平福2, 左伟勇1
（1.江苏农牧科技职业学院/江苏省兽用生物制药高技术研究重点实验室,江苏泰州 225300； 2.泰州出入境检验检疫局,江苏泰州 225300）
摘 要：为检测地塞米松对猪感染PRRSV后免疫力及致病性的影响,将6头健康猪平分为2组,分别注射地塞米松和生理盐水,连续注射3 d.检测注射前、注射后1周的PRRSV抗体阳性率及病毒量,观察并记录体温、呼吸、饮食、眼结膜、粪便等临床情况.结果显示,猪的PRRSV抗体阳性率为100%,但注射后的抗体值高于注射前；病毒蛋白半定量结果显示病毒感染量显著增加；注射地塞米松组的猪表现出一定临床症状,而对照组未发生变化.结果表明,地塞米松会增加PRRSV的发病风险,为建立防治PRRSV感染的动物模型奠定了基础,为兽医临床中合理使用糖皮质激素类药物提出新的要求.
关键词：糖皮质类激素；地塞米松；猪繁殖与呼吸综合征病毒；致病性
中图分类号： S858.28文献标志码： A
文章编号：1002-1302(2016)07-0293-02
收稿日期：2015-06-09
基金项目：江苏省科技支撑计划(编号：BE2014380)；江苏农牧科技学院“凤凰人才工程”项目；江苏农牧科技职业学院2014年度重点支持项目(编号：NZD1405)；扬州朝天歌农牧科技有限公司横向合作课题(编号：00010114012).
作者简介：王永娟(1980—),女,博士,副教授,主要从事动物传染病防治研究.E-mail：43088591@.com.
通信作者：左伟勇,博士,教授,主要从事动物传染病防治研究.E-mail：979490023@.com.
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)广泛存在于各养殖场,可引发免疫逃避,呈带毒但不发病、条件性致病状态［1］.发病时表现为PRRSV与其他病原同时存在,呈继发或并发感染［2］.病猪的临床症状变化较大,通常出现体温升高、食欲下降、气喘咳嗽、肢体末端瘀血、共济失调、运动减少、精神状态不佳等症状,死亡率达50%以上,母猪流产率达30%以上,给养猪业造成了巨大损失［3-4］.PRRSV抗体产生较早,但初始1周内产生的抗体不具有中和作用,仅能作为一种指示性抗体用于病毒感染的早期检测；中和抗体产生比较缓慢,一般于病毒感染后1~2个月出现［5］.
地塞米松为代表性糖皮质激素类药物,对抗炎、免疫抑制、抗内毒素、抗休克、影响代谢具有显著作用［6-10］,在兽医临床中被广泛应用于治疗母畜代谢病,或与抗生素联合用于治疗感染性疾病.有报道表明,地塞米松等糖皮质激素可上调PRRSV受体的表达［11］,促进PRRSV感染或致病.拟将地塞米松注射于健康猪,通过临床症状、标志性抗体、病毒量等方面摸索开展PRRSV试验感染的条件,为建立防治PRRSV感染的动物模型奠定基础.
1材料与方法
1.1主要材料
猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒购自中国农业科学院兰州兽医研究所.地塞米松(国药准字H41020036)由江苏农牧科技职业学院动物实习医院提供.RevertAid M-MuLV Reverse Transcriptase、RNase Inhibitor、Taq DNA聚合酶、1 kb DNA Ladder、琼脂糖、病毒RNA提取试剂盒均购自美国Promega公司.
1.2试验动物
30日龄健康仔猪购自江苏省如皋市某规模化养殖猪场.
1.3猪RRSV抗体检测
在如皋市某猪场选取10头未发病的30日龄仔猪,无菌采血并分离血清,按照猪繁殖与呼吸综合征ELISA抗体检测试剂盒使用说明书检测抗体水平,分别读取D450 nm,每个血清样品做2个重复.按照该试剂盒的判断标准,被检血清平均吸光值(S)/标准阴性血清平均吸光值(N)值≥2.40判为阳性,<2.40判为阴性.
1.4适应性饲养与药物注射
根据S/N值判断仔猪的PRRSV抗体阳性率,选择其中读值较低的6头猪,分别称其质量,用耳号钳标记,适应性饲养于经氯仿消毒的畜舍.3 d后,将1~3号猪作为地塞米松注射组,按0.067 mg/kg的剂量进行肌肉注射,每天09：00、15：00各1次,连续注射3 d；将4~6号猪作为生理盐水注射组(阴性对照).
1.5临床症状观察
自注射地塞米松1 d起每天观察并记录食欲、精神状态、皮肤、呼吸、眼结膜、体温、粪便等临床症状,连续观察7 d.
1.6试验猪PRRSV抗体检测
于停止注射1周后无菌采集猪血并分离血清,按照“1.3”节的抗体检测方法分别测定6头猪的D450 nm.
1.7病毒半定量测定
根据GenBank已公布的高致病性PRRSV(HP-PRRSV)、低致病性PRRSV(LP-PRRSV)的Nsp2基因序列,分别设计能扩增出400 bp或(和)264 bp的特异性上、下游引物,同时设计能扩增出600 bp β-actin的上、下游引物［12］.于注射1周后采集6头猪的唾液,按照病毒RNA提取试剂盒说明书提取其总RNA,进行Nsp2基因的半定量RT-PCR检测,电泳后采用ND-1000型分光光度计进行灰度扫描,根据各组Nsp2基因变化判断病毒量.
2结果与分析
2.1猪RRSV抗体
按照PRRSV抗体检测试剂盒说明书,测得10头未发病30日龄仔猪的PRRSV抗体D450 nm值(表1),根据该试剂盒的判断标准,判断10头被检猪的阳性率为100%,但是均未发病.
2.2临床发病记录
按照D450 nm值由低到高的顺序选择6头被检猪进行分组试验,自注射地塞米松1 d起观察每头猪的临床症状.结果显示,生理盐水注射组(对照组)未出现明显临床症状,地塞米松注射组(试验组)的猪出现食欲下降、精神萎靡、皮肤瘀血、眼结膜潮红、腹泻症状.体温记录见图1,呼吸数记录(n等于3)见图2,试验组的体温与呼吸数于注射地塞米松3 d起开始升高.
表1被检猪PRRSV抗体水平测定
组别D450 nm值
12345678910阴性阳性
A0.2310.2230.3120.2560.2690.2510.5660.2270.2990.2360.0520.503
B0.2480.2300.3010.2550.2780.2420.5280.2260.3010.2400.0530.531
2.3试验猪PRRSV抗体
于停止注射1周后测定猪的PRRSV抗体水平,D450 nm吸光值见表2.根据该试剂盒的判断标准,判断试验猪的阳性率与注射前一致,均为100%,但注射组血清的吸光值明显高于对照组血清.
表2试验猪PRRSV抗体水平测定
组
别D450 nm
123456阴性阳性
A0.9800.6850.7010.2290.2640.2540.0490.512
B0.9640.6390.7220.2410.2630.2490.0510.524
2.4病毒基因半定量测定
唾液样品中病毒基因Nsp2的RT-PCR半定量检测结果见图3.6头猪均为LP-PRRSV病毒感染,而无HP-PRRSV病毒感染,试验组猪的病毒基因表达量比对照组提高3倍左右.
3结论与讨论
PRRSV病毒嗜好在肺泡巨噬细胞(PAM)、肺血管内巨噬细胞(PM)内复制［13］,可在数小时至数天内破坏大量巨噬细胞,造成肺、淋巴结的损伤,使其对异物的非特异性吞噬清除功能大幅降低,易继发其他细菌或病毒感染［2］.已有研究表明,其他病原的协同感染往往可刺激PRRSV受体表达,从而使猪更易感染,这是PRRSV常与其他疾病同时存在的根本原因.自然状态下的PRRSV复制不易成功,为在实验室开展PRRS的攻毒保护试验,有必要摸索PRRSV的感染条件.地塞米松等糖皮质激素可上调PRRSV受体的表达［11］,理论上可模拟其他病原促进PRRSV感染或致病.本研究选取感染PRRSV但未发病的猪为试验动物,人为注射地塞米松,结果显示地塞米松注射组的猪可在短时间内出现典型的PRRS症状,且抗体水平及病毒量均明显上升,而对照组未出现异常症状.结果表明,地塞米松可作为诱导剂增加猪感染PRRSV的风险并引起发病,可为今后建立PRRSV相关研究的试验动物模型奠定基础.
动物模型的建立一般应选择SPF动物,在隔离条件下进行试验.鉴于PRRSV带毒猪多、PRRSV抗体阴性猪场较少、SPF猪昂贵且运输不便等试验条件的限制,本试验选取带毒未发病仔猪,确保其他条件完全一致的情况下设立试验组与对照组,从临床症状、标志性抗体、病毒量方面判断地塞米松对PRRSV感染的影响,结果与预期一致,表明此方案具有可行性.
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