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DNA提取方法优化与Taqman探针法检测牛肉与其制品中的
摘 要：以牛肉及其制品为样品,采用SDS法、CTAB法、试剂盒法提取及纯化样品中的DNA,对比分析DNA模板的浓度和纯度.结果表明：试剂盒法提取的DNA在浓度和纯度方面均优于SDS法和CTAB法.采用Taqman探针法对牛肉及其制品中的猪源性成分进行检测,引物探针特异性强,灵敏度达到8.165×l0-5ng/pL.
关键词：DNA提取：猪源性成分：Taqman探针法
肉及其制品是人体蛋白质的重要来源之一,随着我国经济水平的提升,肉及肉制品已经成为人们餐桌的主角.因猪肉与牛肉的差距较大,在利益的驱使下,各种以假乱真,以次充好的事件频频发生.目前检测肉类掺伪的方法有物理方法、化学方法、ELISA方法、色谱法、PCR方法等.随着分子生物技术研究的深入,PCR及荧光定量PCR越来越多地应用于食品检测领域.本文旨在研究牛肉及其制品中DNA的提取纯化方法及采用荧光定量PCR方法中的灵敏度较高的Taqman探针法检测牛肉及其制品中的猪源性成分.
1材料与仪器
1.1实验材料
生牛肉2份（超市）、熟牛肉2份（熟食店）、牛肉卷10份（火锅店、自助餐厅）.
1.2实验仪器及试剂
高速离心机、核酸蛋白分析仪、荧光定量PCR仪；CTAB（生工）、EDTA（碧云天）、SDS（生工）、DNA提取试剂盒（天根）、2×TaqMan FastqPCR Master Mix（生工）.
2实验方法
2.1火锅底料中DNA的提取方法研究
2 .1.1改良CTAB法
称取100 mg粉碎均匀的样品置于2mL离心管中,加入1 000 μL 2%的CTAB裂解液,4μL的RNaseA酶（仅新鲜组织样品加入）,轻柔振荡15 s,静置5 min.然后再加入10μL的蛋白酶K,轻柔振荡15 s,置于60.C水浴30 min,期间颠倒混匀2-3次；12000 rmin离心5 min,取上清液700μL,加入等体积的氯仿-异戊醇(24：1),轻缓颠倒15 s后室温静置1min；12 000 r/min室温下离心10 min,转移上清液于一新的1.5 mL离心管中,加入0.8倍体积预冷的异丙醇,颠倒混匀后于-20.C静置l—2 h沉淀DNA; 12 000 r/min室温离心10 min,弃去上清液,用70%乙醇洗涤沉淀两次.晾干,使用50 μL TE缓冲液溶解DNA沉淀,待测或于-20℃保存备用.
2.1.2改良SDS法
在2mL离心管中加入100 mg样品,加入1mL 20% SDS混匀,65.C水浴30 min,期间颠倒数次；加入200μL 3 moI／L NaAC溶液混匀,4℃15 000 rmin离心10 min;取上清液加等体积氯仿一异戊醇(24：1)混匀,12 000 r/min室温离心2 min,加入0.8体积预冷的异丙醇,沉淀DNA;12 000r/min室温离心5 min,弃上清液；用70%乙醇洗沉淀两次,晾干,使用50μLTE缓冲液溶解DNA沉淀,待测或于-20℃保存备用.
2.1.3试剂盒法
参照说明书.
2.2实时荧光PCR方法检测
2.2.1实时荧光PCR方法
根据标准SN/T3730.8-2013中设计以猪线粒体atp8基因组系列设计的引物与探针,分别提取不同来源的牛肉及其制品中的总DNA作为模板,在荧光定量PCR仪上对目标序列进行扩增.反应体系为：2×TaqManFast qPCR Master Mix 10 μL, DNFBuffer 2μL, 10μM Forward Primer0.4 μL, 10μM Reverse Primer0.4 μL, 10 μM probe 0.4 μL,Template DNA lμL (10-250 ng/μL).反应条件为：94.C,3 min,(94.C,5s；60℃,30 s)40 cycles.内参采集信号为YELLOW,目标模板采集信号为GREEN.
2.2.2检测方法灵敏度与荧光定量标准曲线
将提取自猪肉组织的DNA分别进行10倍等梯度稀释,采用荧光定量PCR方法中的灵敏度较高的Taqman探针法进行检测,以ct值为35时对应的模板DNA的浓度作为该方法的检出限.同时根据各浓度梯度的扩增曲线,建立ct值一模板DNA浓度的标准曲线,可应用于牛肉及其制品中猪源性成分的定量检测.
2.2.3 特异性实验
分别用牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、马肉等动物样品的DNA进行特异性实验.
3结果与分析
3.1样品DNA提取及纯化方法比较
在DNA提取纯化过程中,一般遵循两个原则：一是防止和抑制DNA酶对DNA的降解；二是尽量减少对溶液中的DNA的机械剪切破坏.本研究设计的改良SDS法和改良CTAB法也是基于这两个原则.CTAB是一种阳离子去污剂,具有从低离子强度溶液中沉淀核酸与酸性多聚糖的特性.十二烷基磺酸钠(SDS)是强效表面活性剂,可以将细胞膜裂解.DNA处理结果见表10试剂盒法对生鲜组织及加工食品的提取的DNA的纯度最好,就提取DNA的浓度来说,SDS法及CTAB法提取的DNA的浓度均较高,在300-1000 ng/μL,试剂盒法提取的DNA的浓度在70-110 ng/μL.总的来说,SDS法所用试剂便宜,花费较小,且提取的DNA浓度较高,适合实验室使用；而试剂盒法操作简单迅速,提取DNA的纯度较高,浓度对下一步进行检测适用,不用经过进一步的稀释.
3.2引物与探针特异性
用本实验的引物与探针在相同的荧光反应条件下对猪肉、牛肉、羊肉、兔肉、鸡肉、鸭肉、马肉等动物样品的DNA进行特异性实验,除猪肉出现典型的对数曲线外,其他肉均未出现典型的对数曲线（如图l所示）.
3.3检测方法灵敏度与荧光定量标准曲线
从图2中可以看出,标准曲线方程为Ct等于 -3.617×log(conc)+ 24.860,r2等于0.989 82,表明该方法在DNA模板稀释浓度范围内线性良好.鉴于国内外荧光定量PCR检测技术标准均将ct值为35时的DNA的质量浓度作为方法的检测限,根据本研究的标准曲线,ct值为35时的荧光体系中DNA的质量浓度为8.165×l0-5ng/μL.
4讨论
自国外假牛肉事件以来,我国也加强了对牛肉及其制品的监管,并且每年均针对市场需求对牛肉及其制品进行抽检,监测牛肉的掺伪现象.本研究建立了牛肉及其制品中DNA的提取纯化方法及采用荧光定量PCR方法中的灵敏度较高的Taqman探针法检测牛肉及其制品中的猪源性成分,该方法特异性较好,检测灵敏度高,并且通过建立的标准曲线可以有效地判定样品是掺伪还是污染.运用本方法对市售的牛肉及其制品进行检测,检测出部分样品存在掺伪现象,少量样品存在污染情况.所以本方法可以为监管机关在牛肉及其制品的质量控制提供有力的技术手段.
提取论文范文结:
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