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低分子肝素结构表征技术
周 霞1,2
1 武汉大学药学院 湖北省武汉市 420073 2 辰欣药业股份有限公司 山东省济宁市 272000
【摘 要】低分子肝素属于一种抗凝血类药物,目前已在临床上得到大量使用.该药物具有一定的强极性、微不均一性和硫酸基团较差稳定性,导致对其的结构表征研究工作有一定难度.本文对低分子肝素结构表征技术进行了研究,并详细分析了该药物在电泳、色谱、质谱以及核磁方面的研究成果.
【关键词】低分子肝素；结构；表征；研究
未分级肝素属于一类糖胺聚糖,主要出现在动物体内,在生物学方面拥有抗凝、抗炎和抗癌等功能；即便如此,若长时间使用也会出现大量的不良影响,比如：出血、导致血小板数量减少等[1].低分子肝素是采用化学或者酶法的方式来降解未分级肝素而产生的,它的平均相对分子量不高于八千；与未分级肝素相比之下,低分子肝素的抗血栓功能偏高一些、抗凝血功能偏低一些,它的优势在于：生物利用功能强、体内半衰期较长、轻微出血倾向以及服用后吸收功能强等.
1 低分子肝素的酶解
低分子肝素拥有一定的强极性、微不均一性,很难使用液相分析法将每种组成部分分离开来,一般情况下采用肝素酶充分降解为二糖,也可分开降解为二、四、六和八糖等相对均一的成分,接着再进行进一步分析.肝素酶是通过黄杆菌的分离和纯化而产生,属于一种裂解酶,因其独特的特异性可裂解肝素糖苷键[2].通常情况下,肝素酶被分为肝素酶Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ,这三种肝素酶的底物存在不同差异的特异性.
2 电泳分析法
2.1 聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶电泳属于经典的分离方法之一,将其与酸醋纤维膜电泳和琼脂糖电泳相比较,聚丙烯酰胺凝胶电泳得分辨率要高一些,通常情况下都被用作测定多糖的平均相对分子量、表征低分子肝素和降解产物的寡糖链散步情况.因低分子肝素具有一定微不均一性和高电荷等的特性,使其电泳方法比蛋白质电泳难一些.
2.2 毛细管电泳
因毛细管电泳的优势在于分析速度快、灵敏度和分离度较高、无需消耗太多样品以及缓冲液用量等,故目前已被常用于糖类物质的分析.毛细管电泳从上个世纪九十年代至今均被使用在分析低分子肝素和未分级肝素中,最开始是用在二糖合成和寡糖的分析之中.若使用正极模式来分析二糖的合成,则不容易在一套缓冲液系统中把八种二糖进行基线分离,还存在峰的对称性不好和拖尾严重的现象,使用负极模式就不会出现这些难题.
3 色谱分析法
3.1 尺寸排阻色谱
尺寸排阻色谱是以平均相对分子量大小状态为原则来进行分离物质,而物质存在色谱柱上的总体时间一般来说都和平均相对分子量的对数线性成负相关.通过一组已知平均相对分子量的同种物质设立出峰时间和平均相对分子量大小的准确曲线,再通过未知样品的出峰时间得出它的平均相对分子量大小.这种方法是如今很多国家药典测定低分子肝素平均相对分子量常用的手段.
3.2 离子交换色谱
低分子肝素硫酸基团稳定性较差,含有两个以上硫酸基,附带两个以上负电荷,故强阴离子交换（SAX）在制备和分析中比较常见[3].将SAX 与其余的色谱分离手段进行比较,SAX-HPLC 的分离能力更为强大一些,而制备和半制备的SAX-HPLC还可使用在制备少量低分子肝素酶解后产生的寡糖组成成分中.强阴离子交换也可被用作纯化低分子肝素,如今已经有许多以强阴离子交换原理为基础的固相提取柱.
3.3 离子对反相色谱
通过离子对反相色谱来分析低分子肝素的原则是：给予流动相内增加烷基胺类离子对试剂,作用在于加强低分子肝素和肝素寡糖保存在反相色谱柱上的能力.正常情况下,当低分子肝素的寡糖链很长时,说明硫酸基数量较多,那么融合的离子对剂也相对较多,从而使预存能力变强,在这种情况下便可把低分子肝素按链的长度打开.
4 质谱分析法
4.1 基质辅助激光诱导解析质谱
基质辅助激光诱导解吸质谱的基本原理为：把样品和基质溶液放在样品版上作融合和干燥环节,再进行激光照射环节,待基质充分吸收激光能量后在将样品进行带动,接着从样品板上向外溅射,样品会从固体状态转变为气体状态,再在气体状态中和基质分子进行结合便产生离子化.
4.2 电喷雾电离质谱
电喷雾电离质谱主要是在“离子雾化”的基础上将样品进行电离,因低分子肝素含有较多的硫酸基和羟基,普遍都采用负离子方法[5].因低分子肝素的硫酸基团在进行离子化时比较容易流失,故在使用电喷雾电离质谱法来分析肝素时必须调整质谱要求,尽可的能使用稳定的离子化要求.
5 核磁共振
核磁共振波谱针对分子结构变化具有较高的敏感性,通常被用于表征低分子肝素的结构.虽可从一维1H-NMR 的结局中分析出单糖组成、数量和杂质等的部分信息,但想要得到完全的低分子肝素结构,常常需对2D-NMR 进行分析[6].
6 结束语
低分子肝素具有极性强和结构复杂的特性,故必须采用多种分析方式才能准确的表征低分子肝素的结构.因比较困难才能将低分子肝素的单一组成部分完全分离再进行分析,因此分析和表征低分子肝素降解构成的二糖以及寡糖的结构一直是如今探究的要点.
参考文献
[1] 石峰, 姬胜利, 迟延青等. 低分子肝素的制备方法及其结构与生物活性的关系[J]. 中国生化药物杂志,2003,24(02):101-104.
[2] 廖劲松, 郭勇. 低分子肝素研究进展[J]. 广东药学院学报,2004,20(02):175-178.
[3] 张利赟. 低分子肝素药物的质量标准综述[J]. 科技传播,2010,7(16):91-92.
[4] 丘晓琳, 李国明, 叶俊生等. 低分子肝素/ 壳聚糖/ 海藻酸钠复合微囊的制备及释药性能[J]. 应用化学,2005,22(04):361-366.
[5] 杜旭召, 李道远, 迟连利等. 低分子肝素分析及结构表征方法的研究进展[J]. 食品与药品,2012,23(09):363-365.
[6] 王章杰. 一种低分子肝素完全降解产物的色谱质谱联用检测方法[D]. 山东大学,2014,21(15):45-32.
作者简介
周霞,陕西省汉中市人.大学本科学历.中级职称.研究方向为多糖类药物.
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3、农村新技术杂志
4、现造技术论文