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响应面法优化蛹虫草多肽提取工艺
【摘 要】目的：对蛹虫草多肽提取工艺进行了优化研究；方法：以蛹虫草子实体提取多肽为对象,通过Box-Behnken设计星点响应面实验进行优化实验；结果：优化蛹虫草多肽提取工艺为提取最佳时间为5.39小时,加酶量1.65%,底物浓度9.3%,蛹虫草多肽提取的OD值为0.85g/L；结论：经实验得证,通过星点响应面实验方法进行蛹虫草多肽提取工艺条件优化,结果合理有效,优化效果良好.
【关键词】蛹虫草；响应面；工艺优化
响应面面优化实验则能够对多因素多水平筛选最优条件,获得理想的结果,是目前优化工艺中常用的优化方法[3].本文通过设计星点Box-Behnken响应面实验,以蛹虫草为对象,对多肽提取方法条件进行了优化研究.
1 材料与方法
1.1 实验材料
虫草子实体（沈阳妮子北冬虫夏草种植基地）.
1.2 试剂
胃蛋白酶（活力：3000~3500 u.mg-1）、胰蛋白酶（活力：250 u.mg-1）,均购自北京鼎国昌盛生物技术有限公司,石油醚（30~60℃）,茚三酮.
1.3 北冬虫夏草多肽的提取工艺
脱脂：将北冬虫夏草子实体粉碎,取定量粉末,按1:3（w:v）比例加入石油醚,在55℃恒温下振荡3h,过滤,将滤渣烘干获得脱脂粉.
酶解过程：取3g北冬虫夏草脱脂粉,按底物浓度不同加入一定量蒸馏水,常温静置30min.用NaOH溶液或HCl溶液调节至酶的最佳pH水平,按加酶量不同加入定量蛋白酶,将样品置恒温振荡器中进行水解.水解结束后,样品煮沸10min,使酶失活,冷却,4500r.min-1离心10min,取上清液备用.
1.4 实验仪器
THZ-C恒温振荡器（太仓市实验设备厂）,UV-2550型紫外可见分光光度计（岛津国际贸易有限公司）5430R低温高速离心机（美国eppendorf公司）,AL204电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）.
1.5 星点设计
本研究根据星点设计原理,利用Design-Expert.8.06软件,对蛹虫草多肽提取工艺：时间(因素A)、加酶量(因素B)、底物浓度(因素C)进行了优化试验.本试验采用三因素三水平对提取工艺进行优化,因素水平见表1,并对所得数据进行二次回归拟合,求得回归方程.
2 结果与分析
2.1 Elisa 响应面优化实验设计
对模型进行方差分析,结果见表2.由表2可以看出：模型的P<0.0001,表明模型高度显著,并能解释97.86%的响应值变化（调整确定系数R2等于97.86）.通过上述所得数据,表明该模型具有良好的拟合度及较小的实验误差.
由回归方程系数显著性检验（表2）可知,因素A和因素B对蛹虫草多肽提取影响显著,而因素C对蛹虫草多肽提取影响不显著；因素A^2和C^2对蛹虫草多肽提取影响其曲面效应显著,而B C^2对蛹虫草多肽提取影响曲面效应不显著；因素AC和BC对蛹虫草多肽提取影响很显著,因素AB对蛹虫草多肽提取影响效应比较显著.
我们又对实验结果进行响应面分析,结果见图1至图3.从图1至图3中可以直接看出其中两两影响条件的交互作用是否互相影响,圆形（图1）表示两两影响条件互相作用不显著,而椭圆形（图2图3）则表示两两影响条件互相作用显著.
从图1中可以看出,在底物浓度为9.3%时,提取时间与加酶量的交互影响不显著.图2 显示了在加酶量为最佳(1.65%)时,提取时间与底物浓度对蛹虫草多肽提取影响效应.从其等高线图可以直观的看出此两因素的交互作用比较显著.由图2可知,提取时间与底物浓度都很高时,蛹虫草多肽提取效率高,都低时蛹虫草多肽提取效率低.由此可知,在实验水平范围内,适当调整提取时间与底物浓度.图3显示了在提取时间(5.39小时)时,加酶量与底物浓度对蛹虫草多肽提取的交互影响效应.从其等高线图可以直观看出此两因素的交互作用显著,加酶量与底物浓度存在交互作用.由等高线图和响应面图可知,回归模型存在最大值,即在提取最佳时间为5.39小时,加酶量1.65%,底物浓度9.3%条件下,蛹虫草多肽提取的OD值最大值为0.87.
2.2 重复性实验验证
在优化后的蛹虫草多肽提取工艺下进行5 组平行试验,所得蛹虫草多肽提取量的OD值分别为0.86、0.84、0.84、0.85、0.85,平均值为0.85.通过软件所得的预测值为0.87与验证试验的平均值0.85非常接近,证明应用响应面法优化蛹虫草多肽提取工艺可行.
3 结论
实验结果证明,采用Box-Behnken统计学实验设计方法对蛹虫草多肽提取工艺进行优化,不仅科学合理,而且快速有效.
（通讯作者：苑广信）
参考文献
[1]郑壮丽,黄春花,梅彩英等.蛹虫草国内外研究的新进展[J].环境昆虫学报,2011,33(02):225-233.
蛹虫草论文范文结:
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