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菠萝混合授粉杂交品系表型与其父本来源分析
摘 要：旨在研究菠萝混合授粉杂交品系‘H’的父本来源.比较‘H’与其母本以及混合花粉供体的表型性状；并基于表型性状遗传距离分析及SLAF测序,研究‘H’与混合花粉供体间的遗传相似性及SNP基因型来源.杂交品系‘H’的物候期、植株大小,果实理化品质、色泽等表型性状与花粉供体之一的‘神湾’相当,而部分理化品质指标优于‘神湾’；果实香气物质组分及含量与其母本‘无刺卡因’较接近.果实小于其母本‘无刺卡因’及‘巴厘’,而大于‘神湾’.杂交品系‘H’与‘神湾’间的遗传相似性大于‘H’与‘巴厘’间的遗传相似性.通过SLAF简化基因组测序分析表明,‘H’的父本来源于‘神湾’的可能性大于‘巴厘’.
关键词：菠萝；混合授粉杂交品系；父本来源；表型；SLAF-seq
中图分类号：S668.3 文献标志码：A 论文编号：cjas17070006
0 引言
菠萝[Ananas comosus (L.) Merr.]又称凤梨,属凤梨科(Bromeliaceae)凤梨属(Ananas)草本果树,原产于巴西、阿根廷及巴拉圭一带的热带地区,是著名的热带水果.中国菠萝品种资源有限、栽培品种结构单一,目前主栽品种仍为‘巴厘’,其次是‘无刺卡因’,两者约占中国栽培菠萝的90%.‘神湾’菠萝虽仅主栽于广东省中山市,但因其香味浓郁、品质优越而深受消费者的喜爱.
杂交育种是种质创新、获得植物新品种的有效途径.菠萝自花不育,在杂交授粉时不需去雄套袋,这为菠萝杂交育种创造了方便.混合授粉作为一种有性杂交方式,具有操作简便,花粉来源广泛,后代变异丰富而有利于选择等特点[1],能显著提高杂交的可孕性及选种效率.菠萝‘H’（暂定名）是由‘巴厘’与‘神湾’菠萝的混合花粉授到‘无刺卡因’上而获得的杂交品系,其果实大小适中、产量稳定,果肉爽脆、香甜.
但由于混合花粉授粉杂交后代的父本未知,在进一步安排品种比较试验时有困难[2].现代生物技术分子标记的应用为混合授粉杂交后代的父本鉴定提供了有效方法[2-3].然而植物表型分析因其适应意义和进化意义,仍不失为研究物种变异和进化的有效传统方法[4].基于传统分类学与计算技术结合的数量分类学,依据表型特征对植物进行分析,将定性描述提升为定量的综合分析,可以再现研究对象之间的亲疏关系,使基于表型特征的研究更加高效[5-6].如基于欧氏距离(Euclideandistance)的表型性状遗传相似性分析已广泛用于后代选择[7-8]、种质资源遗传多样性分析[5,9-10].
而基于限制性内切酶酶切的SLAF-seq (specificlength amplified fragment sequencing)技术通过生物信息学进行试验方案系统设计,构建SLAF-seq 文库,筛选特异长度DN段,以高通量测序技术获得海量序列,利用软件进行数据分析比对,获得大量特异DN段,进而依据其序列发展出特异分子标记.SLAFseq技术可用于单体型图谱、遗传图谱、关联性图谱、多态性图谱的构建,为分子育种、系统进化、种质资源鉴定提供重要技术保障[11-13].
本研究以混合授粉杂交菠萝品系‘H’与其母本‘无刺卡因’,以及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’为材料,通过田间试验调查物候期,比较研究植株、果实大小及果实品质、色泽、香气物质组成等；基于以上性状分析‘H’与其母本以及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’间的遗传相似性,并通过SLAF-seq 技术分析了‘H’的父本可能来源.本研究旨在从表型及分子水平为混合授粉杂交品系‘H’父本来源进行分析,为菠萝杂交育种的亲本选择提供参考.
1 材料与方法
1.1 试验地描述
本试验在位于广州市天河区(113.35° N,23.12° E)的广东省农业科学院果树研究所试验果园内进行.试验地土壤为沙壤土；所在区域为南亚热带季风性气候,年平均降雨量1725 mm,年平均气温21.5~22.2℃；最高温出现在7—8 月,28~35℃；最低温出现在12 月—次年2月,平均气温10~15℃.
1.2 试验材料
本试验所用材料为菠萝吸芽苗,苗长约35 cm；包括杂交品系‘H’及其母本‘无刺卡因’,以及混合花粉供体品种‘巴厘’、‘神湾’.
1.3 试验设计
本试验采用随机区组试验,试验地由14 个东西长6 m、南北宽1 m的小区组成,小区间隔0.7 m,平行排列.除两端各留出1 个小区种植非供试菠萝品种作为保护行外,其余12 个小区分别种植供试品种（系）‘H’及‘无刺卡因’、‘巴厘’、‘神湾’,每个品种（系）各种植3 个小区,随机排列.于2013 年3 月中旬种植,每个小区东西走向双行种植,株行距30 cm×30 cm.果园的其他管理一致.
1.4 表型性状观察与测定
分别记录各个品种（系）的在自然条件下的植株初始抽蕾、开花的时间,果实初始成熟时间（果实黄熟,底部1/3 果眼转黄）.植株自然抽蕾时用直尺测定植株的株高,最长叶片长度、宽度；统计自然抽蕾时的植株叶片数；每个小区测定5 株.果实成熟时,从每个小区随机采收6 个果实用于品质等相关性状分析.果实可溶性固形物含量用手持式折光仪测定；果实蔗糖、还原糖、全糖、可滴定酸、维生素C等参考仝月澳和周厚基[14]的方法测定；果实硬度用GY-1 硬度计测定.果实色泽用SP60 色差计（X-rite,美国产）测定.果实香气物质通过固相顶空微萃取,用GC-MS联用仪分析测定[15].
1.5 遗传相似性计算
分别基于物候期、植株大小、果实大小,果实理化品质、色泽、香气物质等6 类指标参数,采用SPSSStatistics17.0软件对杂交品系‘H’与其母本‘无刺卡因’,以及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’间的遗传距离（不相似性系数）进行计算,比较‘H’与‘无刺卡因’、‘巴厘’、‘神湾’间的遗传相似性[16].遗传距离（不相似性系数）越小,表示遗传相似性越高.在基于物候期的遗传距离计算中,将最早抽蕾、开花、成熟的品种（系）定为0,相比较迟n天的则其值记为n.
1.6 基于SLAF-seq的父本来源分析
基于SLAF 测序分析‘H’的父本来源,通过母本‘无刺卡因’和子代‘H’的基因型,根据子代‘H’基因型来源于‘巴厘’、‘神湾’的比例来判断哪个样本作为父本的可能性更高.首先,过滤掉子代或待验证父本是缺失基因型以及2 个待验证父本基因型相同的位点；再过滤掉2 个待验证父本都能提供的基因型位点,留下只能由其中1 个父本提供基因型的位点,然后判断子代基因型的来源.
1.7 统计分析
采用SPSS Statistics17.0 软件进行数据差异显著性分析（邓肯氏新复极差法测验,n≥3）.
2 结果与分析
2.1 主要物候期
表1所列为菠萝杂交品系‘H’与其母本‘无刺卡因’,以及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’植株自然条件下的初始抽蕾、开花以及果实成熟时间.杂交品系‘H’植株的自然抽蕾时间与其母本‘无刺卡因’一样,都在4月3 日开始抽蕾,介于‘巴厘’与‘神湾’之间.‘H’的初始开花时间比其母本‘无刺卡因’略早,与混合授粉花粉供体之一‘神湾’一样,而比‘巴厘’早.‘H’的果实成熟时间早于其母本‘无刺卡因’,而晚于混合花粉供体‘巴厘’及‘神湾’,但与‘神湾’更接近.
2.2 植株大小
表2 所列为菠萝自然抽蕾时的植株大小.杂交品系‘H’自然抽蕾时株高与其母本‘无刺卡因’间无显著差异.在混合花粉供体‘巴厘’与‘神湾’中,‘H’的株高比‘神湾’略高（差异不显著）,而显著低于‘巴厘’.‘H’的叶长低于其母本‘无刺卡因’及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’,其中与‘巴厘’间的差异达到显著水平.‘H’叶宽与‘无刺卡因’及‘巴厘’、‘神湾’间均无显著差异,但与‘无刺卡因’及‘神湾’更接近.‘H’的叶片数显著多于其母本‘无刺卡因’；在‘巴厘’与‘神湾’中,‘H’的叶片数显著多于‘神湾’,而与‘巴厘’差异不显著.
2.3 果实大小
表3 所列为菠萝果实成熟时的纵横径、单果重、果心宽及顶芽长度.杂交品系‘H’的纵径显著低于其母本‘无刺卡因’；在混合花粉供体‘巴厘’与‘神湾’中,‘H’的纵径略高于‘神湾’,而显著低于‘巴厘’.‘H’的横径显著低于‘无刺卡因’,与‘巴厘’无显著差异,但显著高于‘神湾’.‘H’的单果重显著低于其母本‘无刺卡因’及花粉供体之一‘巴厘’；而显著高于‘神湾’.‘H’的果心宽与其母本‘无刺卡因’以及‘神湾’间无显著差异,但显著低于‘巴厘’.‘H’的顶芽长显著低于其母本‘无刺卡因’；但显著高于‘巴厘’及‘神湾’,与‘神湾’更接近.
2.4 果实理化品质
表4 所示为菠萝果实成熟时的理化品质.‘H’的可溶性固形物、蔗糖、全糖、维生素C含量以及硬度等均显著高于其母本‘无刺卡因’以及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’,且在数值上均与‘神湾’更接近.‘H’的还原糖含量显著低于其母本‘无刺卡因’,而与‘巴厘’、‘神湾’无显著差异.‘H’的可滴定酸含量低于其母本‘无刺卡因’及‘巴厘’、‘神湾’,其中与‘神湾’间的差异达到显著水平.‘H’的维生素C含量显著高于‘无刺卡因’以及‘巴厘’、‘神湾’.‘H’的硬度也显著高于‘无刺卡因’以及‘巴厘’、‘神湾’.
2.5 果实色泽
表5 所列为菠萝果实成熟时的果皮、果肉色泽指标.‘H’果皮的L*值与其母本‘无刺卡因’以及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’间均无显著差异.‘H’果皮的a*、b*值均显著低于‘无刺卡因’,而与‘巴厘’、‘神湾’间无显著差异.
‘H’果肉的L*、a*及b*值均显著低于其母本‘无刺卡因’,而与混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’间无显著差异.
2.6 果实香气物质
表6 列出了杂交品系‘H’与其母本‘无刺卡因’,以及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’菠萝果实中检测到的香气物质组分及其相对含量.在‘H’中检测出4 种酯类及7 种烯类香气物质,其总相对含量分别为47.60%及32.47%.在‘无刺卡因’中,检测出2 种酯类香气物质及5 种烯类香气物质,酯类、烯类香气物质总相对含量分别为44.57%及37.61%.在‘巴厘’果实中检测出5 种酯类香气物质及3 种烯类香气物质；酯类香气物质总相对含量为42.71%,烯类香气物质总相对含量为4.68%.在‘神湾’的果实中检测出酯类香气物质5 种,烯类香气物质3 种,酯类、烯类香气物质总相对含量分别为75.62%及6.59%.
从检测出的香气物质分类统计可以看出,检测出的香气物质组分最多的是杂交品系‘H’,其次是混合花粉供体‘巴厘’及‘神湾’,而‘H’的母本‘无刺卡因’中检测出的香气物质组分数最少（表7）.从香气物质的分类可以看出,杂交品系‘H’检测到的酯类香气物质总含量略高于其母本‘无刺卡因’以及‘巴厘’,而明显低于‘神湾’.‘H’的烯类香气物质总含量略低于‘无刺卡因’,而明显高于‘巴厘’及‘神湾’.而‘H’的酯类、烯类香气物质总含量略低于其母本‘无刺卡因’以及‘神湾’,而明显高于‘巴厘’.
2.7 杂交品系H与其亲本间的遗传相似性
表8 所示为基于主要表型性状的‘H’与其亲本间的遗传距离.基于物候期,植株大小,果实大小、理化品质、色泽、香气物质6 类主要表型性状分析,杂交品系‘H’与其母本‘ 无刺卡因’间的遗传距离分别为12.166、10.847、371.945、9.120、74.219 及8.003.‘H’与混合花粉供体之一‘ 巴厘’间的遗传距离分别为14.491、16.315、264.194、8.497、4.758 及43.476；而与‘神湾’间的遗传距离分别为5.000、10.276、227.745、5.832、2.799 及38.580.在‘巴厘’、‘神湾’2 个混合花粉供体中,物候期、植株大小、果实大小、理化品质、色泽、香气物质6 类表型性状分析均表明‘H’与‘神湾’间的遗传距离相对更近,遗传相似性更高.
基于物候期、植株大小、果实大小,果实品质、色泽、香气物质前述6 类指标参数共同综合分析,杂交品系‘H’与其母本‘ 无刺卡因’间的遗传距离最近为379.821；在‘巴厘’、‘神湾’2 个混合花粉供体中,‘H’与‘神湾’的遗传距离相对更近,为231.362,遗传相似性更高.
2.8 基于SLAF-seq的杂交品系H父本来源分析
共获得253506 个SLAF 标签,标签平均测序深度为76.59x,其中,多态性SLAF标签有80353 个,共获得303779 个SNP 标记（表9）.根据SLAF-seq 分析可知待验证父本‘巴厘’、‘神湾’的亲缘关系比较近.在2个混合花粉供体中,根据亲本判断子代基因型的异常率及子代SNP基因型的来源分析表明‘H’的父本来源于‘神湾’的可能性高于‘巴厘’（表10）.
3 讨论与结论
据不完全统计,全世界约有60~70 个栽培菠萝品种[17].近年来不少杂交菠萝品种被选育出来,如美国Del Monte 所选育的‘MD-2’,波多黎各大学农业试验站选出的‘P.R.1-67’,中国台湾省选育出的‘台农’系列品种等都是杂交菠萝品种.以‘无刺卡因’为母本,‘神湾’为父本杂交选育出的‘粤脆’菠萝是中国大陆地区选育出的第一个杂交品种.窦美安等[18]也以‘无刺卡因’和‘巴厘’为亲本杂交获得了多个F1群体单株.
本研究中,‘H’是由‘巴厘’、‘神湾’的混合花粉授到‘无刺卡因’上获得的杂交品系.‘H’的自然抽蕾、开花期与其母本‘无刺卡因’及混合花粉供体的‘巴厘’、‘神湾’等相差不大；成熟期介于母本‘无刺卡因’及‘巴厘’、‘神湾’之间,属中早熟种.‘H’果实大小适中,可溶性固形物、蔗糖、全糖含量比品质相对较优的‘神湾’均高,可滴定酸含量低.体现菠萝果实浓郁芳香的酯类[19]香气物质含量虽比‘神湾’低,但总体高过‘巴厘’及‘无刺卡因’.
然而,由于混合花粉授粉杂交后代的父本来源未知[2],遗传背景不明确,很大程度上限制了从遗传育种到新品种推广工作的开展[20].近年来,AFLP、SSR、SRAP等分子标记技术已成功应用于茶树、枣树、百合等植物后代父本鉴定[2,20-21],通过测算杂交后代与其亲本间的遗传距离为混合授粉杂交后代的父本确定提供了科学参考[20].本研究中,根据SLAF 测序分析表明杂交品系‘H’的父本来源于‘神湾’的可能性高于‘巴厘’.但测序结果表明‘H’杂合SNP基因型来源于‘神湾’(58.3%)与‘巴厘’(41.7%)的比例相差不大,这可能与2 个待验证父本‘巴厘’、‘神湾’的亲缘关系本身就比较接近有关.
表型作为基因的表现型,能一定程度上反映种质间的本质差异,可以快速地分析其遗传变异,常用于在同一生境下对不同种质材料进行表型性状评价[22-23].传统分类学与统计学及计算技术相结合产生的数量分类学,通过计算后代与双亲之间的遗传距离,可以再现研究对象之间的亲疏关系[5],常用来鉴别真假、优势选择以及种质资源聚类分析[24-26].范凯等[27]基于形态学性状（叶长、叶宽、一芽三叶长、一芽三叶百芽质量）的遗传距离分析了茶树自然杂交后代的遗传多样性.王小萍等[10]基于主要生化成分指标（水浸出物、茶多酚、氨基酸、、儿茶素总量、酯型儿茶素总量、简单儿茶素总量等）对茶树进行了资源鉴定及遗传距离分析.本研究中,基于主要物候期、植株大小、果实大小、品质、色泽以及香气物质组成等6 类表型性状对杂交品系‘H’与其母本‘无刺卡因’以及混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’进行了比较；在2 个混合花粉供体‘巴厘’、‘神湾’中,杂交品系‘H’的指标参数整体上与‘神湾’更接近.基于以上6 类参数指标的欧氏遗传距离分析也均显示杂交品系‘H’与‘神湾’间的遗传距离小于‘H’与‘巴厘’间的遗传距离,表明‘神湾’与杂交品系‘H’间的遗传相似性更高.
通过表型的遗传相似性分析及SLAF 测序分析,可以初步认为混合授粉杂交品系‘H’的父本来源于‘神湾’的可能性更大.
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