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小麦链格孢叶枯病病原鉴定
摘 要：将从新疆伊犁地区采集的小麦叶枯病病叶,经分离纯化后,对其病原菌进行形态学观察及分子生物学测定,结果表明,该病原菌为小麦链格孢（AlternariatenuissimaFr.Wiltsh.）.对20个大、小麦品种进行抗病性鉴定,鉴定结果表明,供试的大、小麦品种抗性差异较大,其中小麦具有较好的抗性.
关键词：分子鉴定；小麦叶枯；链格孢；抗病性
小麦叶枯病是一种恶性叶斑病病害,又叫小麦叶疫病[1],在小麦叶片上出现长卵形、椭圆形褐色斑点,进而扩展成长条形和不规则形病斑,周边有亮晕圈.严重发病常导致叶枯、叶片大部死亡.于小麦抽穗期出现叶片甚至叶鞘枯死,造成减产.以往该病是局部零星发生,其危害未引起人们注意[2].近年来,由于农业生态条件的变化和感病品种的推广,小麦叶枯病发生面积逐渐扩大,危害程度日趋严重.据报道,1991年河南省小麦叶枯病发生面积达69.53万hm2.目前,在新疆伊犁地区的麦田也有发生,其发病症状与内地有所差异,该病的发生对小麦生产造成了一定的影响.
要经济有效地控制叶枯病的危害,必须查明病原,摸清其发生流行规律,筛选抗病品种,对症下药.因此,本实验将采用形态学及分子生物学的方法对小麦叶枯病的病原物进行种的鉴定；同时还对20个麦类品种进行抗病性筛选,为有效控制该病害提供理论依据.
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1供试菌株
从新疆伊犁地区麦田采集小麦叶枯病样,经分离纯化获得4个供试菌株,其菌株编号为5-1、5-2、6-1、6-2.
1.1.2供试大、小麦品种
甘啤5号、甘啤3号、新春18号、新引D9、新春10号、新春22号、新春25号、新春18号、新啤2号、大麦D4C － 14、甘啤4号、新引D7、新春23号、新春11号、新春20号、新春21号、新引D5、甘啤1号、新春12号.
1.1.3试剂及培养基
液氮、无菌水、S提取液、酚：氯仿（1∶1）、氯仿∶异戊醇（24∶1）、3M醋酸钠、无水乙醇、70％乙醇、TE溶液、模板cDNA、10×buffer、200μmdNTP、Taq酶、双蒸水、石英砂、琼脂、0.5×TEB缓冲液.PDA培养基、PCA培养基[1]（土豆：20g、胡萝卜：25g、琼脂：20g、蒸馏水：1000mL）及查氏培养液.
1.1.4所用引物
引物I（ITS1）序列：TCCGTAGGTGAACCTGCGG,引物2（ITS4）序列：TCCTCCGCTTATTGATATGC
1.1.5仪器
光学显微镜、孢子测微仪、挑针、培养箱、台尺、目尺、研钵、1.5mL离心管、水浴锅、4℃冷冻离心机、PCR扩增仪、移液、一次性医用薄膜手套、离心管、普通喷壶、无菌水、标签、记号笔、塑料布.
1.2试验方法
1.2.1形态学鉴定
1.2.1.1供试菌株菌落形态的观察
将供试菌株置于PDA培养基上25℃下培养7d,观察菌落的培养性状及颜色.
1.2.1.2供试菌株孢子形态及着生方式的观察
在光学显微镜下测量孢子长、宽,并记录孢子的横隔与纵隔膜数[3].在25℃的培养箱内培养2～3d后,在显微镜下观察病原物孢子的着生方式.
1.2.1.3不同温度梯度下病原物的生长速率测定
将培养5d的供试菌株的菌落用直径为0.6cm的打孔器打菌饼,菌饼接种至PDA培养基上,然后分别放在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃的培养箱内（每个温度做3个重复）培养,每隔2d测量1次菌落大小,一共测定3次,采用十字交叉法测量,求出平均值.
1.2.2分子生物学鉴定
1.2.2.1供试菌株总DNA的提取
（1）将供试菌株接种至查氏培养液,在25℃、160rpm的摇床上摇培7d后将菌丝用灭菌纱布过滤,干燥后用灭菌的离心管装好,保藏在-20℃冰箱内待用.（2）菌丝体经灭菌水冲洗后,真空抽干水分,加液氮将菌丝体研磨成细粉状.（3）将菌粉装到1.5mL离心管1/3处,向离心管加入S提取液720μL,混匀,65℃水浴1h后,4℃冷冻离心机上13000rpm/min离心10min,取上清液.（4）上清液中加入氯仿∶异戊醇（24∶1）600μL,混匀,4℃冷冻离心机上13000rpm/min离心10min,取上清液.（5）上清液用600μL的氯仿：异戊醇（24∶1）抽提1次,4℃冷冻离心机上13000rpm/min离心10min,取上清液.（6）上清液中加入0.1倍体积醋酸钠和2.0倍体积冰冷的无水乙醇,放置-20℃低温冰箱内1~2h,4℃冷冻离心机上13000rpm/min离心15min,小心倒去液体.（7）沉淀物用70％冰冷的乙醇清洗2次,在空气中自然干燥,沉淀物用TE溶液重新溶解,置于4℃冰箱中保存.
1.2.2.2PCR反应
取0.2mLPCR薄壁管,依次加入以下试剂模板cDNA：1.0μL×10、10×buffer：2.5μL×10、200μmdNTPs2.0μL×10、0.5μm引物1：1.25μL×10、0.5μm引物2：1.25μL×10、Taq酶：0.2μL×10、双蒸水：16.8μL×10.反应参数设置：94℃预变性5min,94℃变性1min,56℃退火1min,72℃延伸1.5min,74℃延伸10min,产物4℃保存.
1.2.2.3凝胶电泳
（1）取3.0g琼脂与0.5×TEB缓冲液30mL待加热混匀后,制成18孔的凝胶板待用.（2）将微量loadingbuffer与5lPCR扩增产物混匀后,用移液点到胶板孔内,在5V/cm电场强度下电泳,用凝胶成象系统观察和照象.
1.2.3抗病性鉴定
1.2.3.1接种体的制备
将供试菌株接种至查氏培养液,在25℃、160rpm的摇床上摇培7d后将菌丝用灭菌纱布过滤,滤液及菌丝待用.
1.2.3.2接种方法
本试验采用无伤接种与有伤接种2种方法.无伤接种：直接将配好的菌悬液喷至生长20d的麦叶正反面（接种量为50~60mL/盆）.有伤接种：先用石英砂将叶片造成微伤后,再进行喷菌接种,接种量、方法、浓度与无伤接种一样[4-6].接种后立即将营养钵放入水泥池中,喷一定量无菌水后,用塑料布盖在水泥池上方,以保持湿度,48h后通风,正常光照,待病情基本稳定后观察发病情况.
1.2.3.3调查并计算发病率
待病情稳定后,调查发病株数,并计算其发病率.
发病率等于发病株数/总株数×100％（1）
2结果分析
2.1形态学鉴定
2.1.1病原物培养性状及形态特征
培养性状：最初菌落颜色泛绿色,随着培养时间的增加,逐渐为棕褐色,边缘整齐,具4～5层轮纹,有蛛网状白色气生菌丝.
形态特征：初生分生孢子梗从培养基表面或气生菌丝上产生,直或弯曲,分生孢子单生或2～10个链生,孢子链有0～4个简单分枝,个别分枝可从孢子上伸出,产出次生孢子（如图1（A））.分生孢子宽卵球形、椭圆形、棍棒形,有的两侧不对称,壁光滑或具细疣.孢子体褐或深褐,具2～6个横隔,0～3个纵隔或斜隔,分隔处缢缩.孢子体尺度（17.5～45.0）μm×（5.0～22.5）μm.初生和次生分生孢子少数具假喙,喙多不明显（如图1（B））.
2.1.2不同温度梯度下病原物的生长速率
试验结果显示,在15~30℃之间,病原物随着培养温度的升高,菌落生长速率也逐渐加快.该病原物在温度为25~30℃之间生长速率最快,培养7d,其菌落生长直径最大可达8cm；在15℃下生长缓慢,菌落直径在4.3cm左右；然而,在35℃下,其生长速率有所减小,菌落直径在6.5cm左右.随着培养天数的增加,菌落颜色也在逐渐变化,由白色到泛绿色最后为棕褐色.
2.2分子生物学鉴定
2.2.1PCR扩增产物电泳图
利用菌株5-1与6-1提取DNA后,用通用引物ITS1与ITS4进行PCR扩增,由图2可知,均扩增出目的片段,其片段长度基本相同,大小在500bp左右.
2.2.2ITS区段的扩增产物的序列比对
序列分析结果表明,供试菌株ITS序列长度为469bp,将菌株的核糖体DNA - ITS基因在GenBank中进行同源性比较,发现与其同源性达到99％以上的ITS序列菌株有27个,90%以上为小麦链格孢（AlternariatenuissimaFr.Wiltsh.）.结合培养性状、形态学特征和ITS区域的DNA序列分析,进一步证明了本研究供试菌株为小麦链格孢（AlternariatenuissimaFr.Wiltsh.）.
2.3抗病品种鉴定结果
接种后7~9d,病情基本稳定,叶部表现出典型的叶枯病症状.由表1可以得出,在20个供试大、小麦品种中,大麦品种抗病性差,其中甘啤4号与新引D5发病率较高,已达25%以上；而春麦品种则有较好的抗病性,如新春18、新春22其发病率几乎为零.
3结论与讨论
通过观察供试菌株的培养性状及形态特征,同时结合核糖体DNA-ITS序列分析,结果表明,在新疆伊犁地区发生小麦叶枯病的病原物为小麦链格孢（AlternariatenuissimaFr.Wiltsh.）,该种病原物无论在孢子形态上还是在小麦发病后所表现的症状上都与内地所发生的有一定差异.同时,经过抗病性鉴定,结果表明,大麦品种抗病性较差,其中,甘啤4号与新引D5发病率较高,已达25%以上；而春麦品种则有较好的抗病性,如新春18号、新春22号其发病率几乎为零.因此在种植过程中,应该选择种植春麦品种,这样可以减少由该病害引起的经济损失.
参考文献
[1]王春江,商鸿生.小麦叶疫病的诊断和病原菌鉴定[J].植物保护,1999（6）：19-26.
[2]周国顺.小麦叶枯病病原菌及发病动态研究[J].河南职技师院学报,1995,23（3）：44-48.
[3]王洪凯,张天宇,张猛.链格孢属真菌分类研究进展[J].山东农业大学学报（自然科学版）,2001,32（3）：406-410.
[4]丁成,彭晓玲,李国英,等.加工番茄不同品种对早疫病的抗病性鉴定[J].新疆农业科学,2006,43（1）：43-46.
[5]方中达.植病研究法法（第3版）[M].北京：中国农业出版社,1998.
[6]商鸿生,王春江.小麦链格孢叶枯病病原学研究[J].物病理学报,2000,30（2）：129-132.
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