毕业论文网
本论文可用于生产论文范文参考下载，生产相关论文写作参考研究。
水貂出血性肺炎灭活疫苗（B型）生产工艺的建立
杨朋欣 丁国杰 刘可姝 张春媛 王彬/ 哈药集团生物疫苗有限公司
水貂出血性肺炎是由绿脓杆菌（又称铜绿假单胞菌,Pseudomonas aeruginosa）感染引起的一种高度致死性传染病,多发于每年9 至11 月份,该菌可通过患病水貂形成的飞沫及气溶胶传播.发病急、死亡快,所以又称铜绿假单胞菌肺炎,以呼吸困难、口鼻出血、突发性死亡为主要特征,死后典型症状为口鼻流出血样泡沫,剖检肺脏呈弥漫性出血.
一般对该病的控制采取抗生素治疗,但该方法易产生耐药性,因此疫苗的制备是控制该病较好的手段,本研究对B 型绿脓杆菌疫苗制备生产工艺进行优化,获得安全、免疫效力良好的灭活产品,为水貂多价疫苗和联苗产品的制备提供理论依据.
一、材料
1．菌株.水貂绿脓杆菌血清B 型SD004 株由哈药集团生物疫苗有限公司研发中心保存.
2．主要试剂及仪器.甲醛溶液和NaCl 均购自国药集团；LB 和TSB 均购自OXOID ；发酵罐购自福州福尔流体设备有限公司.
二、方法
(一)一级种子的繁殖
还原绿脓杆菌B 型SD004 株冻干菌种,划线接种含5% 牛血清肉汤琼脂平板,37℃培养过夜,挑取单个典型菌落,接种5.0 ml 含5% 牛血清肉汤培养基,37℃,180 r/min,培养16 h,经纯检合格后,作为一级种子.
(二)二级种子的繁殖
将检验合格的一级种子按培养基总量的1% 接种含5% 牛血清肉汤培养基,37℃ 180 r/min,培养16 h,经纯粹检验合格后,作为二级种子.
(三)发酵培养时间优化
将各生产用菌种按培养液总量的1% 接种TSB,生物发酵罐进行培养,37℃通气培养24 h,自第6 h 开始,每2 h 收获菌液,按此工艺平行3 次,其搅拌速度为180 r/min,取样并进行活菌计数,取三次试验结果的平均值,分别绘制该菌各血清型的生长曲线.
(四)灭活工艺优化
将制备好的水貂绿脓杆菌浓缩菌液分为成5 组,分别加入终浓度为0.1％、0.2%、0.3％和0.4％的甲醛溶液,同时设未灭活对照,37℃灭活24 h,60 r/h,分别于第12、14、16、18、20、22 和24 小时取样进行灭活检验.
(五)安全性试验
按照优化后的生产工艺制备疫苗分别进行对非靶动物安全性试验,对靶动物单剂量和超剂量安全性试验.
1．对非靶动物的安全性试验.疫苗腹腔接种5 只18 ～ 20 g 小鼠,0.3 ml/ 只,另5 只作为对照,接种后观察14 日,记录小鼠局部及全身反应情况.
2．靶动物单剂量和超剂量免疫安全性试验.选取15 只2 月龄水貂,随机分为3 组,5 只/ 组,分别进行免疫,单剂量组1.0 ml/ 只,超剂量组2.0 ml/ 只,另5只为对照.免疫后观察14 日,记录水貂局部及全身反应情况.
(六)效力试验
1．对水貂的效力试验.取2 ～ 5 月龄健康易感水貂10 只,随机分为2 组,每组5 只.第1 组水貂皮射疫苗1.0 ml/ 只；第2 组水貂不免疫作为对照.免后21日,两组水貂分别滴鼻接种10LD50 的SD004 株菌液0.2 ml,攻毒后观察7 日.对照组水貂应全部死亡,免疫 组水貂应至少保护4 只.
2．对小鼠的效力试验.取体重18 ～ 20 g 清洁级昆明小鼠20 只,随机分为 2 组,每组10 只.第1 组小鼠各腹腔注射疫苗0.3 ml ；第2 组小鼠不免疫作为对照.
免后21 日,两组小鼠分别滴鼻接种10LD50 的SD004 株菌液0.1ml,攻毒后观察7 日.对照组小鼠应全部死亡,免疫组小鼠应至少保护8 只.
三、结果
(一)发酵罐培养时间优化结果
培养B 型菌液, 以活菌计数对数为纵坐标绘制的生长曲线结果如图1 所示,在相同条件下,菌株在14 ～ 16 h 培养范围内细菌存活数为高峰,考虑实际操作最佳培养时间为16 h.
(二)灭活工艺优化结果
通过对灭活工艺进行优化,根据最终制备疫苗的甲醛含量,同时结合选择甲醛浓度的灭活效果,结果如表1所示,37℃条件下,选择按菌液总量的0.3％加入甲醛溶液,灭活24 h 最为适合,能够保证灭活效果.
四、疫苗的安全性试验结果
（一）疫苗对非靶动物的安全试验结果
疫苗对小鼠的安全性试验结果见表5,在观察期内小鼠全部健活,临床表现正常、免疫局部和全身无不良反应.
（二）最小使用日龄靶动物单剂量免疫的安全试验结果
疫苗对最小使用日龄靶动物单剂量免疫安全性试验结果见表3,单剂量接种2 月龄水貂后,在观察期内水貂全部健活,临床表现均正常、注射局部和全身无不良反应,全部存活.
（三）靶动物一次超剂量免疫安全性试验结果
疫苗对靶动物一次超剂量免疫安全性试验结果见表4.超剂量接种2 月龄水貂后,在观察期内水貂全部健活,临床表现正常、免疫局部和全身无不良反应,全部存活.
（四）疫苗的效力试验结果
1. 对水貂的效力试验结果.B 型灭活疫苗免后21日攻毒,疫苗免疫组水貂保护率为5/5,对照组水貂全部死亡（表5）.
2．对小鼠的效力试验结果.免后21 日攻毒,三批疫苗免疫组小鼠保护率为9/10,对照组小鼠全部死亡（表6）.
五、讨论
中国于上世纪80 年代初首次报道了水貂出血性肺炎病例,此后相继有该病报道,调查发现中国各地水貂出血性肺炎B 型菌株流行情况为8% ～ 50% 不等,由于各血清型之间无交叉保护,制备的单苗具有针对性.因此,研制一种防治水貂出血性肺炎的安全性好、保护效力高的灭活疫苗具有重要的现实意义,本试验通过对制苗工艺的优化获得安全免疫效力较好的疫苗,在灭活时间上22 h 也可以,但考虑到生产风险等因素,选择更为稳定的24 h.
参考文献（略）
生产论文范文结:
关于本文可作为生产方面的大学硕士与本科毕业论文生产论文开题报告范文和职称论文论文写作参考文献下载。
1、化工安全生产论文
2、安全生产管理论文
3、安全生产的论文
4、精益生产论文
6、安全生产论文