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质谱技术在抗体药物分析中的应用
摘 要：质谱技术是抗体药物分析最重要的技术手段之一.本文简述了抗体药物的发展和质谱技术的原理.对于质谱技术在抗体药物的分析中应用进行了归类整理,主要分为在一级结构和高级结构分析中的应用.
关键词：抗体药物 质谱 一级结构 高级结构
单克隆抗体药物的发展起源于1975 年,Kohler 和Milstein创立杂交瘤技术,为大量制备鼠源单克隆抗体提供了技术条件,开创了大规模制备单克隆抗体时代.抗体类药物是指含有抗体片段的蛋白类药物,所以在恶性肿瘤、自身免疫性疾病、心血管疾病、感染和器官移植排斥等重大疾病上得到了快速的发展,是当前生物药物领域增长最快的一类药物.[1]
1.抗体药物发展新趋势
在生物药物领域,抗体药物占据着越来越重要的地位,2015年全球销售排名前10 位的药物中有6 个为抗体药物,分别是humira、enbrel、remicade、rituxan、astin 和Herceptin.抗体药物按来源分类可以分为：鼠源单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源抗体.目前,FDA 批准的单克隆抗体药物中,人源化单抗和全人源单抗数量已占据72%[2]
1.1 抗体药物偶联物（ADC）
抗体药物偶联物（ADC）由单克隆抗体和小分子化合物两部分组成.通过抗体的靶向作用,ADC 的抗体部分和肿瘤细胞表面抗原特异性识别并结合,通过细胞内吞作用,将抗体和小分子化合物一起带进肿瘤细胞内部,释放出小分子化合物.[3]这样既可以降低小分子药物的毒性,同时具有靶向结合的作用.已经上市的两个ADC 是Kadyla 和Adcetris.
1.2 双特异性抗体（BsAb）
双特异性抗体（BsAb）是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体,能在靶细胞和功能分子（细胞）之间架起桥梁,.由于基因工程的发展,目前双特异性抗体已经研发出多种类型[4],主要类型有三功能双特异性抗体、IgG-scFv、三价双特异性分子、串联单链抗体（串联scFv）、DVD-Ig 等多种形式.
2.质谱技术
近年来质谱仪性能的显著改进主要基于开发出的两种离子化技术：一种是介质辅助的激光解吸/离子化[5]技术.另一种是电喷雾离子化[6]技术.由于这两种电离技术的出现,使原本只能检测小分支的质谱技术,可以运用于检测生物大分子.
在过去质谱技术主要运用于对一级结构和序列的表征,而现在质谱技术越来越多地运用于高级结构的分析,而高级结构对于抗体药物的生物活性至关重要.
3.质谱技术在抗体药物一级结构分析中的应用
3.1 完整抗体药物精确分子量测定
当得到抗体药物时,可以直接通过高分辨率的MALDI-TOF或者ESI-MS 进行分子量的检测.通过对于脱糖后分子量的检测,可以对于抗体药物进行初步定性分析,并将可以作为药物常规放行的分析方法[7].对于脱糖前的抗体药物进行分析,可以得到抗体药物的糖基化类型的信息及糖基化水平的分布[8],对于快速了解生产工艺与药物质量的关系具有十分重要的意义.
3.2 药物抗体偶联比（DAR）
对于赖氨酸链接的抗体偶联药物,采用 色谱柱及联用的质谱对去糖基化样品进行分析,根据偶联不同数目药物分子的质量数增加判断偶联数目[9].对于质谱测定的结果,不仅可以给出确切的药物抗体偶联比值,更能够给出链接不同个小分子药物的分布情况,及反应过程副产物空链接头的分布情况.[10]
3.3 肽指纹图谱
蛋白被特异酶切微店的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱.由于不同的抗体药物具有不同的氨基酸序列,蛋白质被酶水解后,产生的肽片段也各不相同,肽混合物的质量数医具有指纹特征.可以通过LC-ESI-MS 进行肽片段的一级质量数的鉴定,也可以通过LC-ESI-MS/MS 对于每个肽片段进行进一步确证,提高肽指纹图谱的准确性.
3.4 翻译后修饰研究
蛋白质的翻译后修饰（PTM）对于抗体药物的生物学功能十分重要.常见的翻译后修饰有：磷酸化、脱酰胺、甲硫氨酸氧化、糖基化修饰、N 端焦谷氨酸环化,C 端赖氨酸切除等.质谱分析仪检测蛋白和肽片段的分子量偏差,可以实现高灵敏、高通量和高精确地鉴别蛋白质的翻译后修饰的种类.[11]
3.5 N 端氨基酸序列检测
常规N 端氨基酸检测用Edman 降解法进行检测,但是抗体药物有时候会出现N 端环化的现象,在这种情况下用Edman降解法需要先对抗体进行去封闭处理,而直接使用质谱可以直接测出N 端的氨基酸序列,同时可以检测出N 端环化的相对比例.[12]
4.质谱技术在抗体药物高级结构分析中的应用
4.1 氢/氘交换质谱（HDX-MS）
常规的质谱只能获得蛋白的一级结构信息.氢/氘交换质谱（HDX-MS）可以进行蛋白质构象,溶液动力学和表位映射进行分析.在能够调查的蛋白质的高阶结构和动态结构技术中,HDX-MS 已经证明适合单克隆抗体和单克隆抗体 - 抗原复合物的构象分析.
4.2 离子淌度质谱法（IM-MS）.
离子淌度是根据蛋白的电荷和形状选择性分离的方法,可以区分相同分子量的蛋白和肽段,可用于检测蛋白的简单高级结构.
4.3 高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）高分辨率傅立叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）能够检测最高质量数的质谱仪器,并且有着很高的分辨率.
FTICR-MS 是目前被公认为是蛋白质组学研究的有力工具,特别是和完整的蛋白质鉴定和上/下调翻译后修饰（PTM）蛋白质的鉴定.
4.小结
随着抗体药物的不断发展,需要对于抗体药物的结构信息不断进行深入的分析,质谱技术也随着这一要求不断进步.在现阶段,由于生物质谱分析的成本很高,并且对于人员的要求比较高,所以使其应用受到了限制.当然随着技术的进步,可以预见质谱分析会越来越多地运用于抗体分析中,特别是在高级结构分析的领域,通过质谱分析,可以让我们更多获得高级结构的信息,这对于抗体药物的分析是极为重要的.
参考文献：
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作者简介：高燕波（1990~）,女,研究方向为抗体药物研发.正在攻读上海交通大学生物工程专业硕士；Email：gaoyanbo_1990@163.com
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