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樟树枝叶提取物的不同组分的抗病虫害活性
摘 要：樟树枝叶中富含精油和多种活性成分,具有抗过敏,消炎,抗菌,驱虫等功效.采用活性追踪法,对樟树枝叶提取物的昆虫拒食反应及抗菌活性进行了研究,详细考察了樟树枝叶提取物的不同极性段对菜青虫的拒食作用以及对稻瘟病菌、立枯丝核病菌、黄瓜枯萎病菌、灰霉病菌、玉米大斑病菌、禾谷镰刀菌的抑制效果.实验结果表明,樟树枝叶提取物对菜青虫具有中等拒食作用；对立枯丝核病菌、稻瘟病菌、灰霉病菌具有显著的抑制作用.
关键词：樟树；生物农药；拒食；抑菌
0引言
农业是社会和经济发展的基础,农业安全关乎国家安全与稳定.农作物的病虫害是农业生产过程中不可避免的障碍之一.病虫害的发生往往给农业生产造成巨大损失.其中由植物病原真菌引起的病害几率最大,约占全部植物病害的70%左右.几乎每种农作物都有数种真菌病害,而且有些病原真菌的危害极大,会导致农作物大幅度减产,甚至造成绝产绝收.化学农药曾为农业丰产、稳产做出过重要贡献,但是在使用过程中也相继出现各种负作用,如环境污染、农药残留、病虫产生抗药性以及对非靶生物的毒性等.与化学农药相比,自然来源的生物农药毒性较小、选择性强、残留少、环境兼容性好、资源丰富.对植物源抗虫抗菌剂的研究,不仅有利于植物资源的开发利用,而且从中筛选出的抗病虫害活性成分具有特异的靶向性和自然可降解性,由于其自然属性决定了其无残留,无重金属,环境友好或环境相容性.因此,从野生植物中提取分离和纯化到抗菌驱虫化合物是研制与开发新型生物农药的重要途径之一.
樟树是樟科（Lauraceae）樟属植物,别名香樟、樟木等,系常绿乔木.樟树分布广泛,产于我国南方各省区,为热带和亚热带常绿阔叶林的代表树种.樟树枝叶有芳香味,其中的芳樟醇、黄樟油素、樟脑、龙脑、橙花叔醇、异橙花叔醇、柠檬醛、香叶醇等化合物是樟树枝叶精油的主要成分.有研究表明,樟树的茎、叶、根、果实、樟树籽等各部分粗提物都具有一定的生物活性,主要涉及抑菌、防腐保鲜、驱虫、抗氧化、消炎、细胞毒活性等方面,其开发利用前景广阔.虽然也有很多有关樟树在生物农药方面的研究,但还停留在实验室阶段,而且多数报道都是利用数据库比对以确定物质的存在,很少拿到化合物甚至进行抗菌抗虫活性检测,因此很难发现具有高效抗虫抑菌活性的新物质.有报道对樟树粗提物做了活性检测,但没有获得确定的组分或单体,不知道什么物质具有活性.目前,在生物农药研究领域,依旧停留在基础研究和实验室阶段,如何将樟树的成分研究从实验室走向产业,开发出创新型绿色生物农药以取代化学农药,是目前科研工作的重点.由于樟树资源极为丰富,作为生物农药开发资源,具有广阔的市场前景和科学意义.
为此,我们采用活性追踪法,通过高通量抗菌活性筛选方法的建立以及香樟树活性成分高效提取分离工艺的开发,对香樟树枝叶提取物不同组分的抗虫抑菌效果进行了研究.在研究中发现樟树枝叶提取物的数个组分对几种常见植物病原真菌具有很好的抑制作用,如稻瘟病菌、立枯丝核菌、黄瓜枯萎病菌和灰霉病菌等.为继续开发植物源抗虫抑菌生物农药奠定了物质和实验基础.
1材料与方法
1.1供试材料
樟树（Cinnamomumcamphora）枝叶采集于浙江省嘉兴市南湖区浙江清华长三角研究院园区的樟树林,初步鉴定为樟科芳樟树,标本存放于浙江清华长三角研究院现代农业工程技术研究所实验室内.
菜青虫,从浙华农业公司实验基地的大棚中采捉,放入培养皿中以甘蓝叶片喂饲,待幼虫发育至4龄时用于实验.
植物真菌：稻瘟病菌（有性态Mgnaporthegrisea/无性态Pyriculariaoryzae）、立枯丝核菌（Rhizoctoniasolani）、黄瓜枯萎病菌（Fusariumoxysporum）、灰霉病菌（Botrytiscinerea）、玉米大斑病菌（Exserohilumturcicum）、禾谷镰刀菌（Fusariumgraminearum）均由浙江大学提供.培养于恒温培养箱（温度28-29℃,湿度70-80%）.
1.2试验方法
1.2.1樟树枝叶活性物质的提取.采用超声辅助冷浸法对樟树枝叶进行了提取,将樟树新鲜枝叶粉碎后晾干,称取8kg干燥樟树粉用5倍试剂量70%甲醇常温超声辅助提取三次,每次4h,合并提取液,减压浓缩后得到浸膏700g.
1.2.2樟树枝叶活性物质的初步分离.取700g樟树浸膏加4L水制成悬浮液置于萃取器中,加4L乙酸乙酯搅拌,静置1h后分层,水相反复萃取三次,合并乙酸乙酯相,减压浓缩成浸膏,得到乙酸乙酯相粗提物180g.根据活性追踪法,经正相柱层析、SephadexLH-20凝胶、HPLC等手段分离到数种具有一定抗虫抗菌活性的组分.将这些活性组分配制成一定浓度的稀释液,以备活性检测使用.
1.2.3非选择性拒食作用测定.拒食活性测定采用叶碟法.将新鲜的甘蓝叶片用圆形打孔器打成直径为2cm的叶碟.放入供试样品的稀释液（将筛选到的C,D,F组分用丙酮/水稀释成0.5%,1%,1.5%,2%的溶液）中浸5s,取出晾干,每10片处理叶碟为一组称总重并记录,放入垫有滤纸（加少量蒸馏水保湿）的直径为9cm的培养皿中,接入已饥饿4h的幼虫20只（忽略性别）,重复3次,相应浓度的丙酮+水稀释液为对照.24h后,重新称量每个培养皿中剩余叶片的总重量,计算拒食率.用下列公式计算拒食率：
非选择性拒食率（%）等于（对照组试虫取食重量—处理组试虫取食重量）/对照组试虫取食重量×100%
1.2.4抗菌活性测定.樟树提取物的不同组分对病原菌菌丝生长抑制作用的测定采用生长速率法.
含药平板的制备：称取一定量的樟树不同分离组分,用适量丙酮/吐温-80溶解,取一定量的母液加入到200mLPDA培养基,混匀后制成一定浓度的含药平板.将培养好的活跃供试菌从菌丝边缘打取直径5mm的菌块,将其置于培养皿中间,每个处理重复3次；以不含有植物提取物的丙酮/吐温-80混合液作空白对照.之后将培养皿置于25℃恒温培养箱内培养,培养一段时间后分别测量菌落直径,并与空白对照相比较,计算生长抑制率.计算公式如下：
生长抑制率（%）等于（对照菌落直径-处理后菌落直径）/（对照菌落直径-5mm）×100%
2结果与分析
2.1化学组分的分离与活性筛选
樟树枝叶经粉碎,溶剂提取、萃取分别得到乙酸乙酯相和水相粗提物.在活性追踪指导下,对乙酸乙酯相进行分离得到了A～H八个不同组分.对其中的各组分进行了菜青虫拒食活性和抗菌活性研究.筛选结果表明,其中的D组分有较强的菜青虫拒食活性,同时D和F组分对数种农作物致病真菌有较强的抗菌活性.
2.2非选择性拒食作用
我们将粗分离得到的C,D,F组分分别对菜青虫进行了拒食效果实验.首先,将各组分用丙酮/水稀释为浓度0.5%,1%,1.5%,2%的待测样品溶液,采用叶碟法对菜青虫进行测试,随着浓度的增大,各组分的拒食效果均有所增强.如表1所示,其中D组分对菜青虫的拒食作用最明显,随着浓度的增加,平均拒食率从8.2%提高到17.6%.由于实验条件所限,我们实验用菜青虫是农田现场抓获,供试虫体的性别、本身的耐药性也存在个体差异,导致实验效果没有预期的理想.预计随着提取物有效成分浓度的增大以及在实验室统一培养条件下,对菜青虫的拒食作用会进一步增强（表1）.
2.3抗菌活性研究
抗菌试验选择了灰霉病菌（ZAU10）,立枯丝核菌（ZAU05）,稻瘟病菌（Guy-11）和黄瓜枯萎病菌（FOC）,玉米大斑病（ZAU08）,禾谷镰刀菌（ZAU23）等6种病原菌.首先用分离得到的A-H8种组分对灰霉病菌（ZAU10）,立枯丝核菌（ZAU05）,稻瘟病菌（Guy-11）和黄瓜枯萎病菌（FOC）4种病原菌进行了抗菌活性检测.如表2所示,H组分几乎没有效果,G组分虽然有一定抑菌作用,但是效果较差,对四种真菌的抑制率只有5%～22%.其余组分对四种致病真菌均有不同程度的抑制效果.其中A组分对Guy-11抑制率为42%,对FOC的抑制率为35%,对另外两种真菌的抑制效果较差.B组分对ZAU05抑制率达到71%,对FOC抑制率也较高为41%.其中D和F组分的抑菌效果最好,D组分对ZAU10,ZAU05,Cuy-11和FOC的抑制率分别为89%,71%,64%和93%,F组分对这四种菌的抑制率分别为94%,92%,37%和98%.
此外,我们对D组分进行了进一步分离,又得到了八种成分,用丙酮配制成50mg/ml的药液,吸取一定量的药液加入到培养基中,每个培养基中的浓度为2mg/ml,采用生长速率法分别对灰霉病菌（ZAU10）,立枯丝核菌（ZAU05）,稻瘟病菌（Guy-11）和黄瓜枯萎病菌（FOC）4种病原菌进行了抗菌活性检测.如表3所示,D1对ZAU05的抑制率为54.04%,对另外三种真菌的抑制率较低,尤其是对Guy11的抑制率是-3.92%,表明D1成分对Guy11的生长反而有促进作用.D2成分对四种真菌的抑制效果最好,其抑制率分别为59.13%（ZAU10）,74.75%（ZAU10）,48.04%（Guy-11）和48.79%（FOC）.其中只有对ZAU05的抑制率比D组分高,其他成分的抑制率均低于D2成分.实验结果表明,D组分比其再分离得到的成分的抑菌效果更好,这也是生物农药的特点之一,数种成分组合在一起具有协同作用.D3～D8成分的抑菌率较低,有些成分对四种真菌均没有抑制作用,如D3,D5,D6,D7,D8对FOC均没有抑制作用,D8对ZAU10生长有促进作用.总体来看,将D组分再分离之后所得到的成分的抑菌效率会降低,表明数种成分组合在一起的效果则更好（表3）.
我们进一步对F组分进行了分离,得到六种组分用丙酮配置成50mg/ml的药液,吸取一定量的药液使每个培养基中的浓度为2mg/ml,采用生长速率法对灰霉病菌（ZAU10）,玉米大斑病菌（ZAU08）,禾谷镰刀病菌（ZAU23）和黄瓜枯萎病菌（FOC）4种病原菌其进行抗菌实验研究.如表4显示,实验5天后观察发现F1对ZAU08、ZAU10、ZAU23的抑制率分别为13.01%、25.18%、24.33%,F2对ZAU10、ZAU23、FOC抑制率分别为57.01%、46.54%、21.11%,令我们高兴的是,F3对ZAU08、ZAU10、FOC的抑制率效果很好,分别为97.08%、100%、95.05%,F4对ZAU10、ZAU23、FOC的抑制率分别为35.07%、100%、27.58%；F5对ZAU10、ZAU23、FOC的抑制率分别为94.51%、84.07%、83.15%.令我们意外的是,F组分中F3、F5的抑菌效果竟然与粗提物F组分的效果相当,如F对ZAU10的抑制率为92%,对FOC的抑制率为98%；F3和F5对ZAU10的抑制率分别为100%、94%；F3和F5对FOC的抑制率分别为95%、83%,这可能由于F3和F5中的活性成分恰好协同作用来抑制致病真菌的活性.如图1列出了F组分的实验图片,接下来我们打算将活性较好的F3、F5进一步分离确定活性单体的结构.
4结语
我们利用资源丰富的樟树作为原料,通过提取,萃取,柱层析等手段得到8种组分,根据活性追踪发现其中的D和F组分对四种常见农作物致病菌具有明显的抑制作用.其中F组分对灰霉病菌（ZAU10）的抑制率达到94%,对立枯丝核菌（ZAU05）达到92%,对黄瓜枯萎病菌（FOC）达到98%.D组分对立枯丝核菌、稻瘟病菌和黄瓜枯萎病菌的抑制率分别为71%,64%和93%.F组分对玉米大斑病菌（ZAU08）、灰霉病菌、禾谷镰刀菌、黄瓜枯萎病菌抑制率可达到87%、100%、100%、95%,表明樟树枝叶的某些提取物对于农作物致病真菌具有很强的抑制作用.我们对D组分和F组分进一步分离并进行了抑菌实验,结果发现D组分细分后活性普遍比D组分活性低,而F组分细分后的F3、F5组分的活性与F组分相当,这可能是F3、F5组分的活性成分恰好起到协同作用,其他的无活性成分被分到了其他组分中,避免干扰有效成分的效果.为了弄清楚原因,接下来要继续分离直到拿到活性单体化合物.
由于樟树枝叶提取物或气分离组分具有毒性低,易降解,无重金属,无有机磷,不易残留等优点,因此具有开发出新型生物农药的巨大潜力.我们将进一步对抗菌活性较强的组分进行分离纯化,获得单体化合物,并通过分子结构鉴定了解该组分的成分构成与配比,为新型生物农药的开发与研制奠定理论和实验基础.
参考文献
[1]陈晓雯,芳菁,我国农药使用状况和农药对健康的影响研究[J].卫生软科学,2012,26（6）：560-562.
[2]McDuffieHH,PahwaP,MclaughlinJR,etal.Non-Hodgkin’slymphomaandspecificpesticidesexposuresinmen：cross-Canadastudyofpesticidesandhealth[J].Cancer-EpidemiolBiomarksPrev,2001,10（11）：1155-1163.
[3]BeaneFreemanLE,BonnerA,BlairA,etal.Cancerincidenceamongmalepesticideapplicationsintheagriculturalhealthstudycohortexposedtodiazinon[J].AmericanJournalofEpidemiol,2005,162（11）：1070-1079.
[4]LeyRE,LozuponeCA,HamadyM,etal.Worldswithinworlds：evolutionofthevertebrategutmicrobiota[J].Naturereviews,2008,6（10）：776-789.
[5]JiaW,LiH,ZhaoL,etal.Gutmicrobiota：apotentialnewterritoryfordrugtargeting[J].Naturereviews,2008,7（2）：123-129.
[6]张党权,郭林林.樟树叶化学成分的GC/MS分析[J].中南林业科技大学学报,2010,30（10）：117-120.
[7]ChenY,DaiG.AntifungalactivityofplantextractsagainstColletotrichumlagenarium,thecausalagentofanthracnoseincucumber[J].JournaloftheScienceofFoodandAgriculture,2012,（92）：1937-1943.
[8]JadhMV,SharmaRC,RathoreManseeGAK.EffectofCinnamomumcamphoraonhumanspermmotilityandspermviability[J].JournalofClinicalResearchLetters,2010,（1）：1-10.
[9]RangariP.Screeningofantibacterialsensitivtyofessentialoilsofcamphorandcinnamon[J].ShodhAnusandhanSamachar,2011,（1）：22-26.
[10]OrwaC,MutuaA,KindtR.Cinnamomumcamphora[J].AgroforestryDatabase,2009,（40）：1-5.
[11]ChuSSDuSS,LiuZL.FumigantcompoundromtheessentialoilofChineseBlumeabalsamiferaleesagainstthemaizeweevil（Sitophiluszeamais）[J].JournalofChemistry,2013,（9）：201-209.
[12]陶光复.湖北樟油化学资源[J].长江流域资源与环境,2003,12（2）：124-129.
[13]SahenaF,ZaidulI,JinapS,etal.ApplicationofsupercriticalCO2inlipidextraction：Areview[J].JournalofFoodEngineering,2009,95（2）：240-253.
[14]MiyazawaM,HashimotoY,TaniguehiY.HeadspaeeconstituentsofthetreeremainofCinnamomumcamphora[J].NaturalProductLetters,2001,15（1）：63-69.
[15]ChenH,DaiG.ZhaoJ.Removalofcopper（II）ionsbyabiosorbent-Cinnamomumcamphoraleespowder[J].JounalofHazardousMaterials,2010,177（1-3）：228-236.
[16]叶强,睢凤英,张红玉,等.基于挥发油含量和抗菌活性的樟树叶最佳采摘期研究[J].中华中医药学刊,2014,32（6）：1420-1421.
[17]ZhuF,GuoY.AnalysisofthevolatilecomponentsintheleesofCinnamomumcamphorabystaticheadspacegaschromatographymassspectrometrycombinedwithaccurateweightmeasurement[J].ChineseJournalofChemistry,2010,28（8）：1451-1456.
[18]GargSN,GuptaD,CharlesR.Volatileoilconstituentsofleaf,stem,andbarkofCinnamomumcamphora（Linn.）NeesandEberm（Apotentialsourceofcamphor）[J].IndianPerfumer,2002,46（1）：41-44.
病虫害论文范文结:
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