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激光扫描共聚焦显微镜在生物医学中和应用
1665 年,第一台光学显微镜的问世,为人类打开了微观世界的大门,成为研究生物器官、组织和细胞的重要工具,极大地推动了生命科学相关领域的发展.随着现代科学技术的飞速发展,以及医疗、生命科学、材料科学以及相关工业领域等的广泛应用需求,人们对微观事物的认知要求已不仅局限于二维图像观测,同时需要对微小物体的三维结构进行了解和研究.普通显微镜原理为物面前后一定厚度内飞所有断层图像的叠加,已无法达到应用需求.1951 年,Yong J.Z.提出了飞点扫描显微镜的概念[1],打破传统光学显微镜将整幅图像同时成在系统像面上的方法,转而通过扫描激光光点与样品之间的相对运动,建立物点与像面点间的对应关系.1957 年,Marin M.首次阐述了扫描共聚焦显微镜技术的基本原理[2].1987 年,剑桥医学研究委员会分子生物学实验室设计出激光扫描共聚焦显微镜（LSCM, LaserScanning Confocal Microscope）,并用免疫荧光标记法使得胚胎的大分子物质成功显示,同时实现了技术和设备的商业化[3].国内对于激光扫描共聚焦显微镜的研究起步较晚,2002年胡茂海等推出了一台具有自主知识产权的商业化激光扫描共聚焦显微镜[4].LSCM不仅可以在像面上获得高倍放大率和高对比度的图像,还可通过亚微米级轴向分辨能力实现图像的层析,从而在一系列不同高度上建立高分辨率光学断层图像,辅助以计算机图像处理技术,实现了微小结构的三维成像,成为20 世纪80 年展起来的一项高新技术.
技术和设备的改良可以极大地促进相关领域的发展,同时更高更广的应用需求是推动技术和设备发展的重要动力.本文在介绍LSCM成像原理,分析技术特点的同时,对其在不同领域的应用情况进行了多方面的探讨,以期为更多领域的科研技术人员提供应用参考.
1 光学成像原理
LSCM 主要基于共轭焦点技术设计而成,即以激光作为光源,采集时使激光光源、被测样品和探测器处于彼此的共轭位置上.基本工作过程为：光源发射出的激光束经挡板上的照明针孔后形成一个点光源,其射出飞光线经双色反射镜发射后,通过显微物镜聚焦到样品上的一点,该点由光源照射激发出荧光,透过显微物镜和双色发射镜聚焦到探测针孔形成共焦点,可由光电倍增管探测收集,被探测点所在的平面即为共交平面,经过计算机处理、成像和存储过程,便得到了交面上一点的成像.同时,激光光束对样品进行切面扫描,便可实现该平面的光学断层成像,载物台沿Z 轴方向缓慢移动,可以使不同深度的样品层进入焦平面,又可得到不同深度样品层的成像.成像过程中,只有样品焦平面上的点所激发的荧光可以在检测针孔正确聚焦,从而备光电探测器接收,焦平面以外的光线到达检测针孔时处于离焦状态,因此被直接滤除,可见共焦探测针孔就像一个滤波器,非共焦面的背景均呈黑色,增强了反差,极大地提高了激光扫描共聚焦显微成像系统的清晰度.
2 技术发展优势
2.1 更高的清晰度和分辨率
LSCM 最基本的优势在于利用激光代替传统场光源,通过空间过滤技术消除了聚焦平面以外的次级荧光等信号干扰,可对较厚的样本进行显微CT,整体对比度提高,从而使得分析区域内的图像更为清晰.同时,ZOOM功能可使其在不改变物镜的前提下对样本进行放大扫描,只要数值孔径满足要求,即可反映物镜的最佳分辨率,可达到与利用高放大率、低数值孔径物镜直接获取的无放大图像一样的效果.在X/Y 平面,LSCM 的分辨率比传统光学显微镜提高了1.4倍[5].
2.2 从二维平面迈向三维空间
由上文中所阐述的构造原理可见,LSCM 在可以清晰地获得XY平面内的光学切片的同时,还能够通过控制装有马达的载物台沿Z 轴方向移动来调节样本扫描过程,在Z 轴不同层面上连续断层扫描,得到样本横向纵深平面结构.利用如此逐层扫描得到一系列高反差高分辨率、高灵敏度的二维图像,通过模拟样本三维旋转和空间变换的共聚焦三维重构软件,可以建立简单的三维图像,使人们探索微观世界的范畴从二维平面走向了三维空间.
2.3 灵活多变的实时光波调控系统
LSCM 一方面可以通过在激光整合器后加入声光调制滤片系统实现局部光操作,即同时分别控制各个波段激光照射强度或者同一波段激光在任意时间的照射强度,对图像上特定区域进行扫描成像.另一方面可通过扫描单位内的滤光片转轮,使用不同程度的带通滤光片同时获取多标记荧光,与此同时还可在激发过程中采用顺序扫描的模式,减少了多色荧光间的波段叠加,比年了激发光对不同染料的交叉激发,实现了实时多通道荧光采集.通过如上灵活多变的光波调控系统,可以同时对2-3 种不同的荧光染料分别标记的样品结构进行一次性观察,实现不同结构组分的定性和定量分析.
3 现有技术存在的问题
3.1 快速扫描与高分辨率之间的矛盾
LSCM通过单个像素扫描获取图像,点扫描特性所依赖的机械构造注定该技术是部相对缓慢的扫描仪器,对于一幅典型的1024*1024 像素的图像,用一个常用的2 微秒每个像素点停留时间,仅形成一幅图像的时间就长达超过2秒.其检测范围受到生化过程反应速度的制约,对于活体观察还有一定的局限性.要提高扫描速度,通常需要牺牲图像分辨率,例如碟片共聚焦技术实现了多点成像,使成像速度进一步提高[6],采用的面阵图像传感器量子效率比较高,获得的图像信噪比较高,但杂散光会通过临近的针孔进入面阵探测器,从而降低图像的对比度,影响分辨率,同时由于针孔的大小不像LSCM 一样可以调节,从而无法调控图像分辨率.
3.2 低光毒性与高分辨率之间的矛盾
LSCM 还面临着高分辨率和低光毒性间相互矛盾难以平衡的问题,提高图像分辨率需要加强荧光信号,增强激光照射功率和时间,这种光的强度通常比一个典型的宽场荧光显微镜荧光灯强度超过1000 倍以上,从而造成光漂白导致的光毒性,降低染料荧光寿命和样品的存活率等.而在现有的技术制约下,降低光毒性意味着减少激光照射功率和时间,不利于荧光信号的收集[7].目前,许多新技术如光门控、磷砷化镓混合检测器、高速扫描、光片技术、超高分辨率等,都是以降低背景信号,增强灵敏度,在使用较弱功率激光下提高信号强度为目的.但从总体上来看在降低光毒性等方面的改良还不尽完美,在实际观察中往往很难达到极限分辨率.
4 在不同领域应用研究进展
4.1 在生物及医学研究中的应用
随着激光共聚焦扫描技术的不断发展和完善,LSCM 在生物学及医学相关领域的应用越来越广泛和深入,已经渗透到分子生物学、基因组学、细胞生物学、病毒学、细菌学、组织生物学、胚胎学、免疫学、病理学、流行病学、皮肤病学、肿瘤等相关分支领域.通过它可以直接观测到细胞形态学的组织、细胞之间的相互作用、细胞的光学老化过程、紫外光对细胞的作用、细胞对过敏和刺激作用的反应、真菌感染、组织微环境、伤口的愈合和组织重建、药物扩散等现象.
LSCM 可很好地补充或替代许多操作繁琐的实验技术对植物组织细胞进行观察.Christensen（1997）利用LSCM快速准确地观察拟南芥雌配子体的发育,朱东姿等（2014）学者研究出利用LSCM 观察蔷薇科植物雌配子体发育的方法,代替了繁琐的石蜡切片法以甜樱桃为例,将其胚囊用戊二醛固定,脱水透明后直接用LSCM 观察,用488nm 激光激发后,细胞核和核仁有很强的自发荧光,细胞质液泡则没有自发荧光,因此根据胚囊内核的数量、位置、大小,液泡的有无、位置等可以很清楚地观察雌配子体的发育时期[8-9].
酶与底物结合是木质素酶法水解的第一步,是生物炼制的关键过程,Budi 等（2015）利用LSCM 和比率计方法相结合来研究荧光标记的纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶与滤纸纤维的结合情况,建立了评估和量化多种纤维素酶对于细胞壁周围环境的脱位情况分析的方法,其观察结果支持纤维断裂在混乱的初始阶段水解主要是由于机械故障而非由于快速降解的假设[10].
LSCM 非侵入式微观成像模式为肿瘤及炎症等体内组织病变评价提供了便利,被广泛应用于临床实践.Ma 等（2015）利用LSCM对各种非典型皮肤病进行了诊断,尽管参与实验的6例患者没有典型的临床表现,但LSCM可以检测他们的病理变化特点,帮助把他们从其他临床实践疾病中区分出来,并且操作简单方便,可快速给出检查报告,无痛无创,减轻了病人的痛苦,避免了传统组织病理学活检带来的创伤[11].
虹膜在眼部生理和疾病的发病机制中扮演着重要角色,但非侵入式的体内虹膜超微结构研究在技术上是一大挑战,Li 等（2016）利用LSCM 对31 位虹膜粘连但角膜透明的病人的进行了检查,观察到类树干状结构、树枝/ 灌木状结构、果实特征结构、上皮状结构、深层结构等一些可能的结构变异,同时发现颜料粒子的减少可能会导致廷德尔的积极现象[12].
4.2 在材料生产检测领域中的应用
除了在生物及医学研究领域,LSCM 在陶瓷、金属、半导体、芯片等材料科学及生产检测领域中也具有广泛的应用.例如,钢的铸造组织一般比较粗大,可直接用LSCM 进行观察[13],同时可以利用其模拟微合金钢在不同冷却工艺下的凝固以及奥氏体不锈钢的敏化过程,原位观察过程中样品表面的变化及与第二相析出情况[14-16].在其他材料方面的应也越发深入,陈登等（2014）采用LSCM 对水泥早期水化过程进行原位观察,通过滴加水使压实体中的水泥水化发现,压实体样品与水接触8 小时,表面生成大量的水化产物,水化1天,则水泥变得微结构逐渐变密实,水化到达稳定期[17].Cznotka 等（2016）利用LSCM通过对8 种覆盖不同流体渗透组件聚酯类聚合物的样品进行观测,设计出一种新的用于高分辨率地形分析的材料表面粗糙状况测定模型,同时成功的实现了聚硅氧烷和聚磷腈新合成的新型修饰结构[18].
5 展望
LSCM 有着独特的激光扫描成像方式及精确的计算机测量定位系统,是普通显微镜和电子显微镜的飞跃和补充,加上高分辨率、高灵敏度和灵活性空间结构观察的独特优势,其成为生命科学、医学以及材料科学相关的诸多重要分支领域的全新科研实验手段和必备研究工具之一,为许多研究者提供了有力的技术支持和新的探索思路.目前该技术还存在着一些不足,扫描速度及光毒性程度与分辨率之间的矛盾,制约了活体细胞和组织荧光成像观测的范围；设备昂贵、对操作人员技术要求高,同样限制了该技术的应用.但研究人员相信,随着现代仪器及科学技术研究的飞速发展,加之诸多应用领域的迫切需求,LSCM 必然会不断改进和完善,在未来的科研工作中有着十分广阔的应用前景.
生物医学论文范文结:
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