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基于核酸适配体一金纳米粒子比色传感器快速检测食品中赭曲霉毒素A
摘 要：本研究以核酸适配体为识别元件实现对赭曲霉毒素A（OTA）的高选择性识别,以及采用金纳米粒子做为比色探针,建立了适用于OTA 快速检测的比色适配体传感器.研究结果表明,该比色传感器对OTA 具有较高的灵敏度和特异性,操作简单快速,能用于实际食品样品中OTA 的快速筛查检测；该比色传感器在520nm 和650nm 下吸光度的比值（A520/A650）与OTA 浓度在0.05~5μM 的范围内呈线性相关,检测限为0.02μM.
关键词：核酸适配体 金纳米粒子 比色传感器 赭曲霉毒素A
前言
赭曲霉毒素是由多种曲霉和青霉菌产生的一类化合物,包括赭曲霉毒素A、B、C、D,4 种结构类似的化合物,其中毒性最大、与人类健康关系最密切、对农作物的污染最重、分布最广的是赭曲霉毒素A(OTA)[1].OTA 以污染粮谷类农作物为主,但相继有报道指出,许多其他种类的食品中也检测出了OTA,如水果、葡萄酒、啤酒、咖啡、可可和巧克力、中草药、调味料等多种植物产品和食品.由于生物蓄积作用,如许多动物性食品尤其是肾脏、肝脏、肌肉、血液,以及乳和乳制品中常有OTA 检出[2].
OTA 在食品中的含量通常较低,但较低含量时就可危害人体健康,因此建立一种具有一定灵敏度与专一性,且简便实用,便于推广的OTA 快速检测方法具有重要意义.目前应用最广泛的OTA 检测方法是高效液相色谱法（HPLC）及高效液相色谱质谱联用法[3],但这些方法存在着前处理复杂,样品提取繁琐、净化过程及检测周期长、仪器昂贵、检测成本高等缺点,而无法用于大量样本的快速筛查.
核酸适配体是新近发展起来的一类由指数富集配基系统进化技术(SELEX) 筛选产生的单链DNA 或RNA 片段,能特异性地结合小分子蛋白质、多肽、有机物、金属离子等各种配体,其作为识别分子在医疗诊断、环境检测、基础分析等多种技术中得到了广泛应用.金纳米粒子具有独特的光学特性,小粒径金纳米粒子（10~100nm）水溶胶一般呈红色,当金纳米粒子由于外在的作用发生聚集时,其吸收峰将变宽并发生红移,其颜色也由红色变为蓝紫色.依据这一现象,将以核酸适配体为识别元件与以金纳米粒子为比色探针相结合,构建的适配体比色探针广泛地用于各种生化检测,检测目标包括生物大分子、癌细胞、金属离子以及有机小分子[4].
本研究开发了一种“双链复合物”模式的比色探针,通过核酸适配体将金纳米粒子连接在一起发生团聚,随着OTA与核酸适配体的结合,DNA 链发生解链,连接在一起的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中,溶液颜色相应发生改变,从而实现食品中OTA 的快速灵敏检测.
1 实验部分
1.1 仪器和试剂
UV-2450 紫外可见分光光度计（ 日本岛津公司）；XS105DU 型电子天平（瑞士Mettler Toledo 公司）；Milli-Q纯水机( 美国Millipore 公司).
氯金酸(HAuCl4) 为分析级,购自于美国Sigma 公司；赭曲霉毒素A 购自于美国Romer 公司； 甲醇（HPLC 级,德国Merck 公司）；其余试剂均为分析纯,实验用水是超纯水（>18 MQ）.
包含核酸适体的DNA 寡聚核苷酸（连接链）和两条与之部分互补的DNA 寡聚核苷酸（分别在3´ 端和5´ 端进行巯基修饰）均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成,其序列如下：
连接链（ 粗斜体为OTA 适配体部分）：5 ´ - A C T C A T C T G T G A A G A ? G A T C G G G T G T G G G T G G C GT A A A G G G A G C A T C G G A C A - 3 ´ ； 5 ´ 端巯基化D N A ：5 ´ - H S - C A C C C G A T C T C T - 3 ´ ； 3 ´ 端巯基化D N A ：5´-TCACAGATGAGTA10-SH-3´； 使用前3 种DNA 链分别用水溶解,配制成100μM 的溶液.
1.2 金纳米粒子的制备
利用柠檬酸钠还原法合成实验用的金纳米粒子.具体方法如下： 将100mL 新鲜配制的1mM 的HAuCl4 溶液加入到锥形瓶中,于恒温电磁搅拌器上加热沸腾2min,然后迅速加入2mL 质量分数为5％的柠檬酸钠溶液,继续搅拌,加热保持沸腾10min,使溶液的颜色由淡变为酒红色,停止加热,搅拌使其冷却至室温,然后将制备的纳米金溶液装入棕色试剂瓶中,置于4℃冰箱中保存备用.
1.3 核酸适配体- 金纳米粒子探针的制备
取5´ 端巯基化DNA 以及3´ 端巯基化DNA 的溶液各100μL 加入10mL 纳米金溶液中,搅拌均匀后,在室温下放置12h,使DNA 链通过Au-S 键结合到纳米金表面,再加入100μL 的包含核酸适配体连接链溶液,混合均匀后,将溶液加热至94℃ 2min,快速冷却至30℃,保持30min,使包含核酸适配体连接链与纳米金表面结合的DNA 杂交.然后在16000rpm 下离心15min,以去除多余的、没有和纳米金结合的DNA 链,加水清洗后再次离心,将制备的核酸适配体-金纳米粒子探针用10mL 浓度为20mM pH等于8.5 的磷酸盐缓冲溶液（PBS）分散,4℃冰箱保存备用.
1.3 核酸适配体- 金纳米粒子比色探针对OTA 的检测
OTA 标准溶液：用甲醇将OTA 溶解配制成1mM 的标准储备溶液,临用前用PBS 稀释成不同浓度的测试液.
实际样品中OTA 的提取：将不含OTA 的玉米样品彻底粉碎后,加入不同浓度的OTA 样品,充分混匀.称取5g 加标样品,加入20mL 80% 的甲醇水溶液作为提取液,涡旋混匀后震荡提取30min,离心后将上清液用氮气吹干,加入200μL 甲醇溶解后,加PBS 缓冲溶液稀释至1mL,通过0.45μm的微孔滤膜过滤后作为测试液.
OTA 测定：将500μL 核酸适配体- 金纳米粒子探针加入测试管中,再加入500μL 待测液,用振荡器混匀,静置反应15min 分钟,即可用肉眼观察颜色变化,实现对OTA 的快速定性检测,用紫外可见分光光度计扫描反应后的溶液,利用加入OTA 后吸光度的变化,实现对OTA 的快速定量检测.
2 结果与讨论
2.1 检测原理
本研究制备的“双链复合物”模式的比色探针的基本原理如图1 所示：
通过两条末端巯基化且与OTA 核酸适配体部分互补的DNA 链对金纳米粒子进行功能化处理,OTA 核酸适配体链作为连接链,与两条部分互补链杂交,使功能化的金纳米粒子发生聚集,当溶液中加入OTA 时,OTA 与核酸适配体的结合,使其DNA 构象发生改变,从而造成适配体链与互补的DNA链发生解链,团聚的金纳米粒子由于静电作用重新分散于溶液中,颜色由蓝紫色变成红色.基于这一原理,可以构建一种比色法来快速灵敏地检测食品中赭曲霉毒素A.
利用投射电子显微镜（TEM）对核酸适配体- 金纳米粒子探针加入OTA 前后的微观形态进行表征,从图1 可以看出,通过DNA 双链的形成,在探针溶液中金纳米颗粒形成团聚物,加入OTA 后,由于核酸适配体链与OTA 的结合,DNA 双链结构被破坏,团聚的金纳米粒子由于静电作用在溶液回分散态.
2.2 目测比色法快速检测OTA
利用核酸适配体- 纳米粒子探针溶液的颜色变化,可以对样品中的OTA 毒素进行快速检测.如图2 所示,在核酸适配体- 金纳米粒子探针溶液溶液中,团聚的金纳米粒子使溶液呈蓝色,加入0.5μM 的OTA 后,溶液变成紫红色,随着加入OTA 浓度的升高,溶液逐渐变成酒红色,根据颜色变化,可以实现对OTA 的定性及半定量检测.而在探针溶液中加入较高浓度（10μM）的赭曲霉毒素B（OTB）后,溶液颜色仍然为蓝色,这一结果说明核酸适配体- 纳米粒子探针对于OTA 具有良好的特异性.
2.3 定量检测OTA
核酸适配体- 纳米粒子探针溶液对OTA 响应过程的颜色变化可以通过分光光度计来测定.金纳米粒子的团聚使核酸适配体- 纳米粒子探针溶液在650nm 左右有较宽的吸收峰,随着OTA 与核酸适配体的结合,金纳米颗粒重新分散在溶液中,其吸收光谱在520nm 处出现一个特征吸收峰,随着OTA 浓度的升高,650nm 下的吸光度（A650） 不断降低,而520nm 下的吸光度（A520）不断增大,两个波长下的吸光度比值A520/A650 与OTA 的浓度在0.05~5μM 的范围内,呈线性相关,线性相关系数为0.996.以空白溶液的3 倍标准偏差计,OTA 的检出限为0.02μM.对于加标浓度分别为5、10、50μg/kg 的玉米粉进行加标测定,回收率在75%~102%之间,相对标准偏差在3.8%~9.6% 之间.
3 结论
本研究基于核酸适配体作为生物识别元件,金纳米粒子作为比色探针,建立了一种适用于OTA 检测的比色适配体传感器,本实验方法操作简单,灵敏度高,特异性强,根据溶液颜色变化,肉眼观察即可对样品中OTA 进行灵敏检出,通过分光光度计对溶液吸收光谱的变化可以对OTA 进行准确地定量检测,实际样品分析检测表明该方法可用于食品中快速筛查检测.
传感器论文范文结:
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