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高能X射线不同剂量率照射宫颈癌HeLa细胞株生物学效应

文/李芷茹1 李超2 曾守群1 黄建鸣3 郞锦义3

【摘要】目的观察高能X 射线不同剂量率照射对宫颈癌HeLa 细胞株克隆形成率,百分存活率及放射生物学参数的影响.方法细胞株采用人宫颈癌HeLa 细胞系,置于5%CO2 饱和湿度的370C 的培养箱中培养.将指数生长期的细胞分别采用2、6、10Gy /min 3个剂量率梯度单次照射,照射剂量分别为O、1、2、4、6、8Gy.放射源采用瓦里安直线加速器(Novalis Tx)6MV X射线,HeLa 细胞在室温下照射,瓶底加2.0 cm 标准组织填充物并使源物距为100 cm.处理后置培养箱中继续培养12d 后0.5%结晶紫染色固定,计数大于50 个细胞的克隆数.每个剂量点设3 瓶细胞,实验重复3次.采用Graphpad Pri 5.0 软件,根据单靶多击数学模型和线性二次方程（LQ）模型拟合细胞存活曲线,求出3 种不同剂量率下Hela细胞相关放射生物学参数.采用SPSS19.0 软件对数据进行统计学分析,组间比较采用随机区组方差分析.结果:1、HeLa 细胞在2、6、10Gy/min 三种剂量率照射后,对克隆形成率和百分存活率的影响差异均有统计学意义,P值分别为0.03 和0.04（P ＜0.05）.2、3 种高能X 线不同剂量率照射下平均α/β 值分别为3.28Gy,、3.35Gy、3.93Gy,2分别为0.79、0.78 、0.75,三种剂量率对生物学参数α/β,Do,Dq,2 差异无统计学意义（P＞0.05）.结论：高能X 射线3 种不同剂量率照射Hela 细胞后,随着剂量率增大,Hela 细胞百分存活率趋势逐渐下降,生物学效应逐渐增加,初步为临床IMRT 治疗提供了放射生物学依据.

【关键词】X 射线、宫颈癌、剂量率、生物学效应

调强放射治疗（Intensity-modulated radiation therapy,IMRT）因为能够在给予肿瘤靶区高剂量的同时,减少肿瘤周围重要脏器或组织的剂量,而广泛地应用于各种肿瘤的放射治疗中.随着调强放疗技术的的发展,特别是静态/ 动态调强放疗、容积调强放疗、断层调强放疗技术的出现,图像引导的调强放射治疗到剂量引导的调强放射治疗的转变,治疗模式与以往常规照射有明显差异.高科技技术的进展使直线加速器的剂量率得到了极大提高,从常规的2Gy/min 已能高达20Gy/min.剂量率改变很可能导致放疗分割方式的改变,因此研究剂量率对肿瘤治疗的影响具有重要意义.本研究通过对人宫颈癌HeLa 细胞株高能X 射线不同剂量率照射后生物学效应的影响,初步探讨了调强放射治疗的放射生物学基础.

1 材料和方法

1.1 宫颈癌细胞株及试剂

人宫颈腺癌HeLa 细胞株由广西医科大学肿瘤研究所提供,RPMI-1640 培养基购自美国Gibco 公司,胎牛血清购自兰州明海生物工程公司,二氧化碳培养箱购自美国Thermo公司,超净工作台由苏州净化设备公司提供,50 mL 一次性培养瓶为美国Corning 公司产品.

1.2 细胞传代、计数

显微镜下观察到细胞贴壁几乎长满,即可传代,约3～4天传一代.细胞计数采用血细胞板计数方法,对压线细胞采取“记上不记下,记左不记右”的原则.

1.3 细胞接种

通过预实验初步描绘HeLa 细胞存活曲线,根据应种细胞数：未照射的对照组细胞接种数/ 该剂量下的细胞存活率,计算出各剂量点应接种细胞数.本研究所接种细胞数取近似整数以确保细胞接种时的准确性.各剂量点接种细胞数见表1.

1.4 细胞照射

选择3 种不同剂量率梯度分别设为2Gy/min 组、6Gy/min组、10Gy/min 组,照射各组不同剂量点已接种相应细胞数的培养瓶于24 小时后照射,射野大小设20×15cm,采用瓦里安直线加速器(Novalis Tx)6MV X线照射,照射方式为机架旋转180℃,培养瓶下垫2.0cm 厚组织补偿垫（固体水）以利于剂量建成（经物理师核定符合照射均匀剂量）,组织补偿垫与培养瓶底面之间紧密衔接,源至瓶底距离为100cm.将HeLa细胞分别按0、1、2、4、6、8Gy 剂量点急速照射一次后放入37℃、5％CO2 恒温恒湿培养箱内培养12 天每个剂量点设三组平行样本,且实验重复3 次.

1.5 细胞克隆计数方法

细胞培养12 天后,从培养箱中取出细胞培养瓶.去除培养基后加入0.5%结晶紫2mL 进行细胞固定染色.5 min 后用自来水冲洗培养瓶,除去残余结晶紫．显微镜下计数每个克隆中细胞个数.照射结束后和存活的细胞个数即为大于50个细胞的克隆数.并计算照射结束后克隆形成率（PE等于克隆形成数/100 ×100%）,细胞百分存活率（等于大于50 个细胞克隆数／(接种细胞个数×PE)×100%）.

1.6 数据处理及统计分析

计算3 个高能X 射线不同剂量率组照射个剂量点细胞数后得出的克隆形成率PE 和细胞百分存活率.采用GraphPad Pri5.0 软件处理各剂量率组的存活率,以单靶多击数学模型拟合曲线,公式为：等于1-(1-e-D/Do)N,e 为自然对数的底,近似等于2.7,logN等于Dq／Do,分别求出3 组细胞放射生物学参数平均致死剂量Do、准阈剂量Dq、外推数N 值；以线性二次方程数学模型拟合曲线,公式为：等于e-αD-βD2,分别求出3 个剂量率组细胞放射生物学参数α、β 值.采用SPSSl9．0 统计软件分别对3 个剂量率照射组中克隆形成率,百分存活率,放射生物学参数数据进行统计分析,组间比较采用随机区组方差分析.

2结果

2.1 高能X 射线三个剂量率组细胞克隆形成率及百分存活率

HeLa 细胞2Gy/min 组、6Gy/min 组、10Gy/min 组分别在0、1、2、4、6、8Gy 各剂量点照射后的细胞克隆形成率及百分存活率见表3,可见随剂量增加,HeLa 细胞百分存活率逐渐降低,随剂量率增加,各平行剂量组细胞百分存活率也相应逐渐降低.随机区组方差分析结果,剂量率和剂量对PE 的影响F值分别为12.94 和2266.93 ,P值分别为0.03 和0.000（P＜0.05）,剂量率和剂量对的影响F值分别为10.69 和2378.87 ,P 值分别为0.04 和0.000（P＜ 0.05）故可认为剂量率和剂量对HeLa 细胞PE 和的影响差异均具有统计学意义

PE:剂量率F等于12.94 P等于0.03 剂量F等于2266.93 P等于0.000

:剂量率F等于10.69 P等于0.04 剂量F等于2378.87 P等于0.000

2生物学参数及存活曲线

采用GraphPad Pri 5.0 软件,分别选取各剂量率组多个剂量点细胞百分存活率以单靶多击模型拟合曲线,得出Hela 细胞放射生物学参数．Do 值分别为2.951Gy、2.834 Gy、2.801 Gy ,Dq 值为0．948 Gy、0．902 Gy 、0.810 Gy, N 值分别为2.095、2.080、1.946 .拟合曲线图上可见三条近似曲线在低剂量处存在一下降肩区,高剂量区为一近似斜向下直线,无明显的肩区和斜率变化.以线性二次方程模型拟合曲线(见图1-2),得出Hela 细胞放射生物学参数α/β 值分别为3.284Gy、3.353Gy、3.927Gy,随着剂量率增加,α/β 值逐渐增大(见表4).随机区组方差分析三种剂量率比较F 值为0.142 ,P值为0.87（P＞0.05）,故可认为三组剂量率对生物学参数α/β,Do,Dq,D37,2 的影响差异无统计学意义.

讨论

IMRT放疗技术在临床的使用提高靶区物理适形性的同时也可能改变剂量输出模式,单次剂量输出时间的长短取决于剂量率的大小.Fowler 等[1-3]研究了揭示10 种正常组织在照射时间延长时生物学效应的变化情况,研究发现在外照射超过30 分钟时,细胞存活分数明显的增加.Shibamoto 等[4]研究也发现鼠肿瘤细胞株E14T6 和SCCVII 在照射时间延长2分钟,亚致死损伤修复就已经开始发生,在延长5 分钟后,EMT6 细胞株存活比率上升了13％,SCCVII 细胞株上升了18％.Wang 等[5]研究人前列腺肿瘤株(α/β等于3.1Gy)在体外照射时间延长时细胞存活比率随之变化,发现对于低α/β 值的肿瘤,单次照射的总时间对生物效应有着更大的影响.

Paganetti 等[6-8]研究了9 个人类细胞肿瘤株,结果提示照射时间大于20min 就将影响到肿瘤细胞的百分存活比率.尽管诸多研究提示剂量率是决定特定剂量所产生的一系列生物反应的主要因素,剂量率降低可导致放射生物效应下降.在使用调强照射技术时,照射时间的延长对细胞的存活分数有着一定程度的影响.而高能X 射线不同固定剂量率传输时间对细胞放射生物学效应的研究甚少.本研究通过对人宫颈癌Hela细胞株高能X 射线不同剂量率照射后生物学效应的影响,初步探索IMRT治疗的放射生物学基础.

细胞克隆形成法能准确反映细胞辐射后具有无限增殖能力的细胞数,至今仍被认为是评价离体细胞放射生物效应最好的手段.单靶多击数学模型拟合曲线所得参数中,最终斜率Do 反映细胞在相对高剂量区对射线的敏感性,Do 值越大,细胞对射线越抗拒,Do 值表示细胞亚致死性损伤修复能力的大小,Dq 值越大,表明细胞亚致死性损伤修复能力越大.LQ 模型中的α 值代表起始斜率,决定低剂量照射下对细胞的损伤程度.β 值代表超线性效应部分,随照射剂量增加而加大,当线性部分与平方部分对细胞杀灭的贡献相等时,其照射剂量等于α/β 值,它也反映细胞亚致死性损伤修复能力的大小,α/β 值越大,细胞亚致死性损伤修复能力越小[9].

线性二次数学方程（LQ）模型为放射生物效应的研究及临床放射治疗计划分割模式的等效生物剂量之间转换提供了可行的方法[10].但LQ 模型也有其局限性,离体细胞实验没有充分考虑到细胞再增殖、再氧化、乏氧及其他外界环境等因素的影响,相对于体内复杂的生物机制试验模型显得简单,能否反应活体内细胞对剂量率的实际生物学效应,还有待于大量的动物试验及临床研究进一步证实.

众所周知,IMRT 的技术优势集中体现在对于靶区的精确定位及高度适形性上[11],这种“精确和完美”是通过改变射束方向、移动床角、增加子野数量来实现的.在输出剂量率不变的情况下无疑会延长治疗时间,进一步会使单位时间内组织的吸收剂量降低.多项研究认为治疗时间延长会降低肿瘤细胞放射生物学效应,同时会引起器官运动变化而造成靶区剂量的不确定性[12-16].单次剂量输出时间的长短依赖于剂量率的大小,随着放射物理技术的飞速发展,直线加速器的输出最大剂量率与常规治疗比较不断提高,因此治疗模式下输出剂量率的改变对细胞生物学效应的影响是我们迫切需要了解的问题.Kamer 等[17]研究了不同分割剂量,剂量率对细胞放射敏感性的影响,也发现随着剂量分割和照射时间的增加,细胞的存活分数不断增大,可能与亚致死损伤修复有关.Harald 等[6]认为治疗时间超过20 分钟才需考虑剂量率效应,也证明了细胞存活分数随输出时间延长而增加.沈捷等[18]研究了三种宫颈癌细胞株不同剂量点照射后,MTT 法2-8Gy/min 剂量率变化对2 影响无差异.本研究HeLa 细胞在2 、6、10Gy/min 高能X 射线剂量率照射后,剂量率对的影响有统计学差异,对各组间生物学参数影响差异无统计学意义.

结论

高能X 射线3 种不同剂量率照射Hela 细胞后,随着剂量率增大,Hela 细胞百分存活率趋势逐渐下降,生物学效应逐渐增加,初步为临床IMRT治疗提供了放射生物学依据.由于本研究仅纳入3 种剂量率,且仅研究了人宫颈腺癌Hela细胞株,对其它输出剂量率梯度及细胞株的影响尚不明确,且缺乏活体组织的研究基础.在未来的研究中可进一步改变剂量率梯度,并且进行更多的动物实验及临床研究深入探讨剂量率对宫颈癌细胞生物学效应的影响.

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【作者简介】

李芷茹,女,四川德阳人,硕士,住院医师,主要从事肿瘤放射治疗的临床研究工作.

通讯作者：郎锦义,男,四川成都人,主任医师,二级教授/医学博士/ 博导,主要从事肿瘤放射治疗的临床研究工作.

（作者单位：1.成都市第五人民医院肿瘤科；2.成都市第二人民医院妇产科；3.四川省肿瘤医院放疗中心）

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