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外源ALA对葡萄果实品质与PAL活性的影响
摘 要：为了探讨4种防冻剂对提高葡萄嫩芽和幼叶抗冻能力的效果,以夏黑葡萄扦插幼苗和巨峰葡萄幼叶为试验材料,分别浸渍一定浓度的苞果303、苞果良、氨基丁酸（FP）和水杨酸,然后进行低温处理,以观察和测定嫩芽和幼叶的受冻害情况.结果表明,500倍苞果303和200 mg/L FP药液在稳定细胞膜透性、降低膜脂过氧化、提高保护酶活性等方面具有较显著的效果,嫩芽和幼叶的霜冻危害显著减轻.因此,苞果303和FP具有提高葡萄嫩芽和幼叶的抗霜冻能力,有一定的推广应用价值.
关键词：葡萄；防冻剂；抗冻能力；冻害指标
葡萄低温冻害在全世界范围内普遍发生,是威胁生产的重大因子.低温冻害按照发生时间可分为早霜冻和晚霜冻两种,早霜冻发生在晚秋早霜来临时,主要危害枝条和根系；晚霜冻发生在葡萄萌芽生长期,主要危害葡萄嫩芽和幼叶.近年来晚霜冻现象比较严重,尤其是随着促早栽培和一年多熟栽培等模式的出现,早春冻害已经成为种植者最担忧的问题之一.陈晓楠指出,葡萄绒球、嫩梢和幼叶、花序分别在环境温度低于-3 ℃、-1 ℃和0 ℃时即会发生冻害[5],这说明葡萄萌芽后,其抗冻性越来越低,而此时期也是发生倒春寒的关键时期.因此,研究提高葡萄防寒抗冻能力的方法具有重要的生产意义.
生产上通常采取的防冻措施包括覆盖、熏烟、喷淋和喷施防冻剂等,前3种方法属于物理防冻法,需要消耗大量的劳动力和资源,植物防冻剂因其操作使用简单、效果好而广受欢迎.关于各种防冻剂的应用和专利产品也成为研究热点.目前,在生产上或研究中用于植物防冻的药剂有氯化钙、硫酸钾、水杨酸、乙烯利、萘乙酸、脱落酸、矮壮素、多效唑等.氨基丁酸（FP）在预防甜樱桃花果晚霜冻方面效果显著,并获得美国专利（专利号：USSP2011/0281730A）.台湾久安公司开发的肥料产品苞果良和苞果303,在2008年春季福建的葡萄晚霜冻期间表现出了良好的抗低温能力.因此,为了明确不同防冻剂在提高葡萄防寒抗冻能力的提升效果,本研究通过浸渍的方法使葡萄嫩芽和幼叶吸剂,冷冻处理后,观察和测定多个评价抗冻能力的指标,以期筛选出对提高葡萄嫩芽和幼叶防冻效果最显著的药剂,为葡萄冻害的防治提供科学的理论依据.
1 材料与方法
1.1 试验材料培养
试验于2013年1～4月在上海交通大学农业与生物学院进行,将夏黑葡萄一年生枝条剪成留2个芽的插穗,顶端离芽约1 cm处平剪,下端在芽眼处斜剪,插入湿沙后置于植物培养箱中培养催芽.培养箱内环境设置为：温度25 ℃,相对湿度90%,12 h光照/12 h黑暗.待芽即将萌发时移入玻璃温室中培养.幼叶的抗冻性试验选用生长在玻璃温室中的20株5年生地栽巨峰葡萄植株作为试验材料,栽培基质为园土:有机肥（8:1,v/v）,肥水管理参考王世平等的方法,2013年巨峰葡萄植株于3月中旬萌芽.
1.2 试验处理
1.2.1 葡萄嫩芽的抗冻性观测
（1）嫩芽的抗冻性预备试验
选取长势一致的夏黑葡萄扦插幼苗20个（最大叶片宽度2 cm左右）,随机分成2组,每组10个幼苗,第一组温度设定为1 ℃、-1 ℃、-3 ℃、-5 ℃、-3 ℃、-1 ℃、1 ℃,置于程序控制冰箱中,为了更准确地测定控温冰箱内的温度变化,同时在放置扦插幼苗的隔板上放置温度测定仪（U23-001,美国Onset公司）,温度变化如图1所示；第二组温度设定为0 ℃、-2 ℃、-4 ℃、-2 ℃、0 ℃,每个温度段保持1 h,之后取出幼苗在室温下放置3 h后观察嫩芽是否发生冻害以及受冻害的程度.
（2）嫩芽的抗冻性观测
选取长势一致的夏黑葡萄扦插幼苗70个,10个幼苗作为对照,其余幼苗置于程序控温冰箱中冷冻处理,温度设定为-3.5 ℃、-4 ℃、-4.5 ℃、-5 ℃、-5.5 ℃、-6 ℃,每个温度段保持1 h,每隔1 h从冰箱中随机取出10个幼苗在室温下放置3 h后观察嫩芽的受冻害情况.
1.2.2 防冻剂处理对葡萄嫩芽抗冻性的影响
选取长势一致的夏黑葡萄扦插幼苗（最大叶片宽度在2 cm左右）250个,随机分成5组,每组50个,分别用500倍苞果303、500倍苞果良、200 mg/L水杨酸和200 mg/L FP浸泡48 h,以去离子水浸泡作为对照.之后置于控温冰箱中,设定温度梯度为-0.5 ℃、-2.5 ℃、-4.5 ℃、 -2.5 ℃、-0.5 ℃,每个温度段保持1 h,程序结束后取出幼苗置于室温下3 h后观察嫩芽的受冻害情况.
1.2.3 防冻剂处理对葡萄幼叶冻害生理生化指标的影响
从巨峰葡萄植株上剪取宽度为5 cm左右的幼叶作为试验材料,分别用500倍苞果303、500倍苞果良、200 mg/L水杨酸、200 mg/L FP和去离子水浸泡叶柄24 h,每个处理20片幼叶,取一半幼叶置于控温冰箱中冷冻,设定温度梯度为-0.5 ℃、-2.5 ℃、-4.5 ℃、-2.5 ℃、-0.5 ℃,每个温度段保持1 h,程序降温处理结束后取出幼叶,置于室温下3 h后测定幼叶的相对电导率、丙二醛（MDA）含量、超氧化物歧化酶（SOD）活性和过氧化物酶（POD）活性.另一半幼叶直接用于测定相同指标.
1.3 指标测定
1.3.1 冻害指数
参考俞奔驰等[12]的冻害等级划分方法对幼叶受冻害情况进行评估.冻害情况共分5个等级,0级：无冻害；1级：轻微冻害,25%嫩叶受冻；2级：25%～50%幼叶受冻；3级：50%～75%幼叶受冻；4级：严重冻害,75%幼叶冻死.
冻害百分率/%等于（发生冻害株数/总株数）×100.
冻害指数等于[Σ（同一冻害等级的株数×该冻害等级代表值）/（调查总株数×最高级冻害代表值）]×100.
1.3.2 相对电导率
参考修德仁等[13]的方法.用直径1 cm的打孔器在幼叶上取5个小圆片,用去离子水反复冲洗干净,置于15 mL离心管中,加入10 mL去离子水,并使叶片完全浸入水中.振荡10 min后,用电导率仪（FE30）测定电导率S1.再置于沸水浴中加热40 min,冷却至室温后,用去离子水定容到加热前的体积后测定电导率S2.相对电导率计算公式：
相对电导率（%,伤害率）等于（S1/S2）×100.
1.3.3 生化指标的测定
MDA含量采用硫代酸法测定,SOD活性采用氮蓝四唑法测定,POD活性采用愈创木酚法测定,酶活力用“U/g”表示.
1.4 数据处理分析
试验数据通过SAS8.0软件进行统计分析,并应用Microsoft Excel 2007软件进行作图.
2 结果与分析
2.1 防冻剂处理对夏黑葡萄嫩芽抗冻性的影响
根据夏黑葡萄嫩芽抗冻性预备试验发现,当温度降到-5 ℃时,夏黑嫩芽发生严重的冻害现象,而当温度降到-4 ℃时,嫩芽几乎没有发生冻害现象,因此初步确定夏黑嫩芽开始发生冻害的温度范围为-4～-5 ℃.之后的嫩芽抗冻性观测试验表明,当温度低于-4.5 ℃时,嫩芽发生冻害的情况明显加重,因此,确定夏黑嫩芽发生冻害的临界温度为-4.5 ℃.另外,500倍苞果303、500倍苞果良、200mg/L水杨酸和200 mg/L FP处理的幼苗冻害百分率和冻害指数均低于对照,说明这4种防冻剂对提高葡萄嫩芽抗冻能力的效果较显著（表1）,其中,夏黑嫩芽发生冻害最轻的处理是200 mg/L FP,其冻害指数比对照减少72.0%；其次是500倍苞果303,比对照减少53.8%.
2.2 防冻剂处理对葡萄幼叶冻害生理生化指标的影响
2.2.1 防冻剂处理对巨峰葡萄幼叶相对电导率的影响
与去离子水处理相比,4种防冻剂浸渍处理均降低了巨峰葡萄幼叶的相对电导率,但降低效果不显著（图2）.经低温冷冻后,葡萄叶片的相对电导率增加,其中,200 mg/L FP处理的增加量最少,仅为17.1%,对照增加54.7%.说明FP对于冷冻后稳定幼叶质膜结构的效果最显著,其细胞膜透性最小；其次是500倍苞果303,比对照低40.9%.总体上,防冻剂处理的叶片相对电导率均低于对照,说明这4种防冻剂处理均提高了葡萄叶片的抗冻性,其中水杨酸的效果最差.
2.2.2 防冻剂处理对巨峰葡萄幼叶MDA含量的影响
与去离子水处理相比,防冻剂浸渍巨峰葡萄叶柄后,幼叶的MDA含量均比对照有所降低,其中500倍苞果303处理的降低幅度最大,比对照低57.2%,其次是500倍苞果良,比对照低54.3%（图3）.经低温冷冻后,幼叶的MDA含量均增加,其中,对照的增加量最大,比冷冻前增加53.3%,说明对照幼叶受到的冻害最严重；防冻剂处理的幼叶MDA含量增加幅度不明显,仅增加5.9%～17.4%.整体上,苞果303处理幼叶的MDA含量最低,为对照的32.4%,这说明苞果303处理的葡萄幼叶膜脂过氧化发生最少,受冻害程度最轻；其次是500倍苞果良处理,200 mg/L水杨酸的效果最差.
2.2.3 防冻剂处理对巨峰葡萄幼叶SOD活性的影响
防冻剂浸渍葡萄叶柄后,幼叶SOD活性增加,其中500倍苞果303处理的SOD活性最强,比对照增加43.4%；其次是200 mg/L FP,比对照增加37.6%（图4）.冷冻处理后,幼叶SOD活性增加,其中FP浸渍处理的葡萄幼叶的SOD活性最强,达到127.4 U/g,比对照高36.6%；苞果303的效果次之,说明这两种药剂在清除幼叶组织和细胞内的超氧阳离子自由基的能力最强,从而减缓氧自由基对细胞膜的损伤,提高幼叶的抗冻性.
2.2.4 防冻剂处理对巨峰葡萄幼叶POD活性的影响
与葡萄叶片SOD活性变化规律相似,防冻剂浸渍后,幼叶POD活性均比对照增强,其中500倍苞果303处理的幼叶POD活性最强,比对照增加206.1%.冷冻处理后,幼叶POD活性增加,其中,200 mg/L FP处理葡萄幼叶的POD活性最强,比冷冻前增加167.5%,比对照增加121.1%（图5）,这说明FP对于冷冻后提高葡萄幼叶降解H2O2能力的效果最显著,从而解除细胞内的有害自由基,增强幼叶的抗冻性.
3 讨论与结论
葡萄发生冻害后,从表面上看叶片呈水渍状萎蔫,而其生理生化指标早已发生改变.本研究中防冻剂浸渍葡萄扦插幼苗后,嫩芽受冻害的百分率和冻害指数均降低（表1）,说明我们所使用的4种防冻剂均提高了葡萄嫩芽的抗冻能力,其中效果最好的药剂是200 mg/L FP和500倍苞果303.
植物抗寒性与细胞膜结构、生理活性及其保护酶活性有密切关系,因此鉴定植物抗寒性的方法有多种,常用的有电导率法、丙二醛、脯氨酸、还原糖、可溶性蛋白、氨基酸、淀粉、脂类物质、膜保护酶SOD活性、POD活性测定法等.这些指标的高低和变化均能够反映植物受冻害的程度或抗寒性的强弱.
生物膜是植物细胞及细胞器与环境的一个界面结构,各种逆境对细胞的影响首先作用于生物膜,低温伤害也是如此.植物的抗寒性强弱与细胞质膜透性呈负相关,电导率是反应质膜透性的主要指标,抗寒性强或受害轻的细胞渗透性和电导率小.研究表明：山葡萄的电导率随温度的降低而升高,之后随温度的升高而降低；总体上电导率随温度的降低呈“S”形曲线.本研究中,叶柄浸泡药液后,幼叶相对电导率降低,说明这4种防冻剂均降低了幼叶的细胞膜透性.低温冷冻后,幼叶相对电导率升高,其中FP处理幼叶的相对电导率最小,说明FP对保护冷冻后幼叶细胞膜结构稳定性的效果最显著,其次是苞果303.
MDA作为膜脂过氧化的最终产物,既能够抑制细胞保护酶的活性和降低抗氧化物的含量,又具有细胞毒性,破坏膜结构.因此,其含量的高低是反映细胞受到伤害程度的重要指标,植物抗寒能力强,该物质含量低,反之则相反[22].本研究中,药液浸泡后,幼叶MDA含量降低,说明4种防冻剂均降低了细胞膜脂过氧化的发生.冷冻处理后,幼叶MDA含量增加,这与之前的研究结果相似.总体上冷冻后防冻剂处理幼叶的MDA含量均显著低于对照幼叶的MDA含量,说明防冻剂处理大大降低了幼叶膜脂过氧化的发生,保护了细胞膜结构,提高了葡萄的抗冻性,其中苞果303的效果最显著.
在逆境环境下,保护酶活性的增加可以抵御逆境产生的伤害.SOD和POD是植物体内清除活性氧和自由基的保护酶,能够减缓氧自由基对细胞膜的损伤,对于维持细胞膜的稳定具有重要作用.研究表明,抗寒性强的葡萄品种,这两种酶的活性较高[24].本研究中防冻剂处理后幼叶SOD活性和POD活性均增强,其中苞果303处理的效果最显著,POD活性比对照增加206.1%.幼叶经过冷冻后,这两种酶活性再次增加,小麦上也有相似的研究结果[23].其中FP处理幼叶的这两种酶活性最强,SOD活性和POD活性分别比对照高36.6%和121.1%,说明FP对提高幼叶保护酶活性的效果最显著,幼叶经冷冻处理后的抗冻性最强,从而增强了幼叶抵御寒冷的伤害.
总之,虽然本研究的低温环境和过程为实验室模拟,但是通过设置去离子水对照处理,在相同的冷冻条件下,防冻剂处理减轻了嫩芽的受冻害程度,稳定了幼叶的细胞膜结构,减少了膜脂过氧化的发生和提高了幼叶抗氧化活性酶的活性,从而提高了葡萄的抗冻性,这对于葡萄生产具有重要的指导意义.
综合各种防冻剂在提高葡萄嫩芽和幼叶的抗冻能力、质膜稳定性、抗氧化活性酶活性和减少膜脂过氧化发生等因素,我们认为500倍苞果303和200 mg/L FP对提高葡萄嫩芽、幼叶的抗晚霜冻能力的效果比较显著.
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