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实验性肝郁证大鼠外周血单个核细胞Toll样受体4信号通路

文/姚凝

【摘 要】目的:分析肝郁证时机体TLR4 信号通路介导的免疫状态;方法:Wistar 大鼠进行肝郁证动物模型制备,检测PBMCs 中toll 样受体4(TLR4)信号通路主要级联分子基因表达水平;TLR4 配体刺激PBMCs 24h,检测在配体诱导下炎性分子和细胞因子的分泌水平;结果:肝郁证大鼠表现出PBMCs 中TLR4 及NF-κB 基因表达下调,并且在特异性配体LPS 刺激下分泌TNF-α,IL-1β 及IL-6 减少.结论:肝郁证下调并抑制PBMCs 中TLR4 信号通路,导致机体相关免疫能力降低.

【关键词】肝郁证;toll 样受体信号通路4;核因子κB;细胞因子

肝郁证是中医证候中的常见证型,随着现代生活节奏的加快,社会竞争的日趋激烈、人际关系的日益复杂化,肝郁证越来越多地见于临床,如焦虑症、神经官能症、抑郁症等无不与肝郁有关,严重地影响着现代人的身心健康.

有研究显示,肝郁证常伴有免疫功能低下表现,免疫细胞分化和增值能力减弱.Toll样受体(TLRs)是近年来备受关注的模式识别受体,在固有免疫系统中起着关键作用.当病原微生物侵入机体时可快速介导机体固有免疫应答,并进一步指导机体产生抗原特异性获得性免疫反应.TLR4 是Toll样受体家族中的重要成员之一,通过TLR4-NF-κB 细胞信号通路促进靶基因活化,引起多种细胞因子分泌,最终导致机体发生相应的免疫应答[1].

本文分析实验性肝郁证模型小鼠外周血单个核细胞(PBMCs)中TLR4 信号通路的表达与功能,以期能进一步阐明肝郁证对机体免疫功能的影响.

1 材料与方法

1.1 实验动物

Wistar 大鼠36 只,雌雄兼用,体重250-300g,兰州生物制品研究所提供(合格证:医动字第14-004 号).

1.2 肝郁证模型制作方法

按文献方法[2],自制中间圆洞直径为2.5cm 的金属枷,重22&plun;1g,可自行拆装,将大鼠用钠常规腹腔麻醉后,采取“颈部带枷单笼喂养法”,复制大鼠肝郁证模型.

1.3 动物分组方法

实验大鼠采用随机分组法共分三组:A 组为正常对照组:正常喂养;B 组为造模两周组:严格按上述方法进行造模;C 组为造模四周组:实验方法同上.

1.4 TLR4 配体

脂多糖(Ultrapure LPS from E. coli 0111:B4,Invivogen,Toulouse, France)应用终浓度为100 ng/mL(/106 cells)[3].

1.5 PBMCs制备

采外周全血肝素抗凝,取等量Hank´s 液与全血充分混匀,缓慢置于淋巴细胞分离液上,低温水平密度梯度离心(4℃,2000ram/min)30min,获得PBMCs(Ficoll-Paque,AmershamParmacia Biotech),洗涤细胞2 次;提取的PBMCs 悬浮于1640 培养基(含10%胎牛血清,100U/mL 青霉素,100μg/mL链霉素,1.5 mM L- 谷氨酰胺),调整细胞浓度为1×106/mL,台盼蓝实验判断细胞存活状态(>98%).

1.6 mRNA 提取及实时定量聚合酶链反应(real-timePCR)

PBMCs 分离后,按照TRIzol 试剂盒说明书操作指南提取mRNA(Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA.).取2 μg 总RNA,加入随机引物(Takara Bio. INC. Japan)制备cDNA.cDNA 采用real-time PCR 进行扩增分析(Bio-RadLaboratories, INC. CA. USA.)并用2-△△Ct 方法进行计算[4].Real-time PCR 反应条件如下:25 μL 反应容积利用SYBR-GREEN 试剂进行荧光检测(Takara Bio. INC. Japan).热循环条件:95°C 5分钟,随后进行45 个循环(95 °C 15秒, 60 °C 30 秒, 72 °C 30 秒).在每循环的最后一个阶段检测反应体系的荧光强度..扩增基因引物见表1:

1.7 抗病毒细胞因子检测:

PBMCs 培养于24 孔板,加入TLR4 特异性配体LPS,刺激24 小时后分别收集细胞培养上清液进行检测,利用ELISA 试剂盒(R&D System, INC. USA.)分析PBMCs 分泌的IL-6,IL-1β 以及TNF-α 含量.

1.8 统计学分析:

采用SPSS13.0 统计分析软件(Statistical Package forSocial Science, Inc., Chicago, IL, USA.).连续变量采用均数&plun;标准差(mean&plun;standard)或者中位数(25% 位数, 75% 位数)表示.连续变量采用Student t- 检验或者Wilcoxon´srank-sumW检验.所有统计分析均基于双侧假设检验,P<0.05 认为具有统计学意义.

2 结果

2.1 实验性肝郁证大鼠PBMCs 中TLR4 基因表达(见图1)

数据显示,实验性肝郁证大鼠PBMCs 中TLR4 基因表达明显下调,尤其是实验性肝郁证大鼠2 周模型组下调最明显.与正常对照组大鼠相比,实验性肝郁证模型2w 组下调1.49 倍(0.97 vs. 0.65,P<0.01),实验性肝郁证模型4w 组下调1.28 倍(0.97 vs 0.76,P<0.05);与实验性肝郁证模型2w 组相比,实验性肝郁证模型4w组上调1.17倍(0.76vs. 0.65,P<0.05).

2.1 实验性肝郁证大鼠PBMCs 中NF-κB 基因表达(见图2)

数据显示,实验性肝郁证大鼠PBMCs 中NF-κB 基因表达明显下调,尤其是实验性肝郁证大鼠2 周模型组下调最明显.与正常对照组大鼠相比,实验性肝郁证模型2w 组下调1.35倍(0.73 vs. 0.54,P<0.01),实验性肝郁证模型4w组下调1.11倍(0.73 vs 0.66,P>0.05);与实验性肝郁证模型2w组相比,实验性肝郁证模型4w组上调1.22倍(0.66vs. 0.54,P<0.05).

2.3 TLR4 特异性配体LPS 刺激PBMCs 分泌细胞因子(见图3)

各实验组大鼠PBMCs 与TLR4 特异性配体LPS 共培养24 小时,数据显示实验性肝郁证大鼠细胞培养上清液中细胞因子分泌降低.正常对照组、实验性肝郁证模型2w 组及实验性肝郁证模型4w 组大鼠TNF-α 分泌为:13.7&plun;2.81ng/L,6.54&plun;1.69 ng/L 与8.13&plun;1.22 ng/L;IL-1β 分泌为:21.9&plun;5.41 ng/L,15.2&plun;4.73 ng/L 与18.3&plun;4.99 ng/L;IL-6 分泌为:87.4&plun;18.7 ng/L,58.3&plun;15.4 ng/L与74.3&plun;17.2 ng/L.

3 讨论

随现代生活节奏的加快,社会竞争日益激烈,肝郁证越来越多地见于临床,《素问·调经论篇》指出“血气不和,百病乃变化而生.”《医经溯洄集·五郁论》指出“凡病之起也,多由于郁,郁者,滞而不通之意.”《丹溪心法》专立有“六郁论”对病因病机分析甚祥:“气血冲和,万病不生,一有拂郁,诸病生焉,故人生诸病,多生于郁.”均认识到气郁在发病中的意义.

本实验采用制造肝郁证动物模型,观察外周血PBMCs中TLR4 信号通路关键分子的表达及特异性配体刺激下信号通路细胞因子分泌能力.实验数据显示,与对照组大鼠相比,实验性肝郁证模型2w 组及4w 组大鼠TLR4 与NF-κB基因表达均下调,但是实验性肝郁证模型4w 组大鼠与2w组模型大鼠相比其基因表达下调有所减轻.TLR4 特异性配体LPS 刺激下,实验性肝郁证模型2w 组及4w 组大鼠PBMCs分泌的TNF-α,IL-1β 及IL-6 与与对照组大鼠相比明显减少,但是实验性肝郁证模型4w 组大鼠与2w 组模型大鼠相比其细胞因子分泌降低有所恢复.

有研究报道,肝郁证时机体免疫功能会有所下降.TLRs属于跨膜蛋白家族成员,并且介导信号转导功能.TLRs 的激活募集了下游相关信号蛋白,导致IκB 磷酸化并与NF-κB分离,游离状态的NF-κB 转位进入核内,最终引起机体相关炎症分子和细胞因子的基因表达.TLR4 特异性识别细菌LPS 分子特殊结构、病毒融合蛋白、病毒膜蛋白及内生性配体(热休克蛋白60,热休克蛋白70,透明质酸低聚糖结构、纤维蛋白原等).LPS 是TLRs 强有力的特异性激活剂,微量即可激活TLR4 的信号通路引起机体相应的免疫反应[5].TNF-α,IL-1β 及IL-6 作为炎性分子及细胞因子,广泛参与到机体的免疫炎症反应.炎性分子或细胞因子的分泌失常,通过机体免疫网络相互影响,导致机体免疫功能紊乱.而TNF-α、IL-6 等的分泌降低,则引起机体免疫调节能力下降,防御功能减低[6].

实验数据显示,肝郁证模型4w 组大鼠与2w 组模型大鼠相比,相关检测指标有所恢复,但是与健康对照组大鼠相比依然明显低下.暗示在肝郁证的过程中,机体会进行自我的适应性调整,但是肝郁的存在最终依然导致机体处于免疫应答低下的状态.

本课题观察到肝郁证时,PBMCs 中TLR4 信号通路关键分子基因表达下调,伴随相关炎性分子与细胞因子的分泌减少,显示肝郁证影响了机体TLR4 介导的免疫通路及功能,导致机体TLR4 介导的免疫应答低下,进一步加重肝郁证时机体免疫及整体状态的紊乱.

肝郁证是否作用于免疫系统其他领域,产生协同致损伤或致紊乱作用,有待于进一步研究.

【作者简介】

姚凝,女,1978.3.硕士,讲师.主要研究方向:中西医结合基础与临床

【基金项目】

甘肃省教育厅基金(No.024-01)

(作者单位:甘肃中医药大学临床医学院)

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