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乳与乳制品中-内酰胺酶快速检测试剂盒的比较
张 威,姜连阁
（黑龙江省食品药品检验检测所,黑龙江 哈尔滨 150088）
摘 要：目的：对乳及乳制品中 β- 内酰胺酶的两种快速检测方法进行对比,并以杯碟法作为参比方法,探求准确、快速和可靠的检测方法.方法：分别采用华安麦科 β- 内酰胺酶快速检测试纸条和 Charm β- 内酰胺酶检测试剂盒对 150 份乳制品进行 β- 内酰胺酶检测,通过与国家指定方法杯碟法比较两种快速检测方法的检出率,进一步确证定性方法性能指标.结果：两种快速检测试剂盒均无假阴性样品出现,其中 Charm 检测试剂盒与国家指定方法有较好的相关性和一致性,可选用 Charm 检测试剂盒作为对大批量样品快速筛查的方法.
关键词：乳制品；β- 内酰胺酶；快速检测方法；Charm 检测试剂盒
中图分类号：R155
牛奶中抗生素残留是我国乃至全球奶牛业普遍存在的问题.目前,多数奶牛畜牧场均在使用抗生素类药物来治疗奶牛疾病[1-2] ,随着抗生素类药物被广泛应用于养殖业,牛奶中抗生素残留问题日趋受到国内外相关人士的正视,但就国内奶牛饲养的大环境而言,其实基本无法把牛奶做到完全“无抗”的程度,去除牛奶中残留的β-内酰胺酶类抗生素, β-内酰胺酶 （生鲜牛乳抗生素分解剂）可能添加到各类乳制品中而起到掩蔽抗生素的作用,但由于现阶段并未知晓这一生物制剂的安全性危害评估,乳制品生产企业严禁在其生产过程中添加 β- 内酰胺酶这一物质.随着公众对于食品安全问题的关注度越来越高,我国已经将 β-内酰胺酶列为用于乳及乳制品掩蔽抗生素的非食用违法添加物质[3] .
目前,乳制品中的 β- 内酰胺酶的检测方法主要有理化法、免疫法、微生物法等,以及以免疫法为基础研制出的快速检测试剂盒法[4] .杯碟法是我国当前认可的针对牛奶制品的主要检测方法,但实验过程较繁琐、 周期较长；碘量法的灵敏度不高、 重现性也较差；酸测定法的假阳性和假阴性问题较严重,一直找不到解决办法；液相色谱法的样品前处理过程繁琐,所用仪器对实验人员要求较高,检测成本昂贵.相比之下,建立准确、快速、可靠的快速检测试剂盒法,不需要对样品进行复杂的前处理过程,操作过程简便且直观易懂.在实际检验检测工作中,β- 内酰胺酶检测方法是否方便、快速、敏感、准确愈来愈受到各界关注.现有的研究中多数为单一方法的探讨,而对于国内外快速检测试剂盒的研究很少,文献中并未报道过对于试剂盒的评价研究,日常工作中缺少适用于检测大批量样品的筛选依据.
本文选用 Charm 和华安麦科快速检测试纸条分别进行牛奶中 β- 内酰胺酶残留的检测,并以杯碟法作为比较,对比其检测结果,了解和探讨各方法的特点及优缺点,为建立不同种类乳及乳制品中 β- 内酰胺酶的快速、准确、可靠的检测方法提供依据.
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
试验样品为 150 份乳制品样品.藤黄微球菌（Micrococcus luteus）CMCC（B）28001,北京嘉世玉禾化工技术研究院；β- 内酰胺酶标准品（3×10 6 U/mL）,中国食品药品检定研究院；氨苄青霉素标准品、舒巴坦标准品,Dr.Ehrenstorfer (Germany)；抗生素鉴定培养基Ⅱ,北京陆桥技术有限责任公司；牛津杯,深圳新拓扑生物科技有限公司；Charm 试剂盒,中检柏泰生物技术（北京）有限公司；β- 内酰胺酶快速检测试纸条,北京华安麦科生物技术有限公司.
1.2 试验方法
1.2.1 样品前处理
调制乳、灭菌乳等液体乳制品以原液检测,奶粉样品按 1 ∶ 10 的比例稀释后检测,酸奶样品经离心后,取中层液体按 1 ∶ 2 的比例稀释,pH 调至 6.0 后检测.
选取其中 50 批阴性样品,分别添加 β- 内酰胺酶标准品（3×10 6 U/mL）使其 β- 内酰胺酶终浓度为 4 U/mL,以此制成的阳性样品作为检测假阴性率的样本.
1.2.2 检测方法
（1）杯碟法.按照国家指定方法卫生部《乳及乳制品中舒巴坦敏感 β- 内酰胺酶类物质检验方法 杯碟法》进行,以抑菌圈差值在 3 mm 以上作为阳性判定标准.
（2）华安麦科 β- 内酰胺酶快速检测试纸条.测定步骤及判定参照试剂盒使用说明进行.
（3）Charm Rosa β- 内酰胺酶试剂盒.测定步骤及判定参照试剂盒使用说明进行.
1.3 评价方法及分析指标
以国家指定方法卫生部《乳及乳制品中舒巴坦敏感 β- 内酰胺酶类物质检验方法 杯碟法》为参考基准方法,用其检测的结果评价快检试剂盒的灵敏度、特异性、符合率（与现有方法一致性分析）及 Youden 指数,快检试剂盒定性方法的性能指标计算方式见表 1,样品情况为由基准方法检验得到的结果,其中灵敏度为参比阳性样品的检出率；特异性为参比阴性样品的阴性率；符合率为快检方法与参比方法检测结果一致的样品数与样品总数之比；Youden 指数由公式（1）计算得出.
Youden 指数 等于 敏感度 + 特异性 -1 （1）
注：N 表示任何特定单元的结果数,第一个下标指行,第二个下标指列.例如,N11 表示第一行,第一列, N1.表示所有的第一行, N2.表示所有的第二列；N12 表示第一行,第二列.
2 结果与分析
2.1 杯蝶法及快检试剂盒法的检测结果
从市场上购买不同品牌的液态乳和奶粉样品,采用杯碟法和快速检测法分别对购置的乳及乳制品进行检测,采用杯碟法在检出限浓度（4 U/mL）下测定（其中 A 加入 10 μL 氨苄青霉素、B 加入 10 μL 氨苄青霉素 +50 μL 舒巴坦、C 加入 10 μL 氨苄青霉素 +50 μLβ- 内酰胺酶、D 加入 10 μL 氨苄青霉素 +50 μL β- 内酰胺酶 +50 μL 舒巴坦）,C 与 D 抑菌圈差值三平行的均值为 3.2 mm,样品的 C 与 D 抑菌圈差值大于此值的均视为阳性.
本实验室在国内外的多种品牌的 β- 内酰胺酶快速检测试剂盒的对比研究中发现,华安麦科及 Charm 品牌与参比方法所测定结果有较高的一致性,因此本次试验选用这两个品牌进行进一步研究.通过两种快速检测试剂盒对50批参比检出限水平阳性样品的检测结果可知,两种快速检测试剂盒均无假阴性样品出现,假阴性率均为 0,说明两种快速检测试剂盒均具有良好的灵敏度.
为进一步考察两种快速检测试剂盒的特异性及一致性评价,在实际操作过程中对 150 批乳制品进行大批量筛查,检测结果显示所测定的液态乳和奶粉样品中阳性样品 12 批,阴性样品 138 批,结果见表 2.在本实验选择的两种快速检测试剂盒中,Charm 试剂盒与杯碟法得出的结果无明显差别,假阳性率仅为 2%,且其标称检出限水平与参比方法一致,均为 4 U/mL,能满足实际样品检测的需要,而华安麦科 β- 内酰胺酶快速检测试纸条因其 2 ～ 4 U/mL 的检出限则出现较多的阳性样品,无法对假阳性率进行确证,但对于实际样品的检测有一定影响,并不利于大批量样品测定的快速筛查工作.
两个品牌的 β- 内酰胺酶快检试剂盒部分检测结果如图 1、图 2 所示.Charm 检测试剂盒 T 线若比 C线深则为阳性（＋）,图 1 中 13 批阴性样品测定结果均为阴性（－）；华安麦科快速检测试纸条 T 线若比C 线深则为阳性（＋）,T 线若未出现则为失效（×）,图 2 中 18 批阴性样品测定结果出现 4 批失效（×）及两批假阳性（＋）.测定过程中发现,Charm 检测试剂盒对样品的测定稳定性较好,而华安麦科 β- 内酰胺酶快速检测试纸条对于样品的要求较高,常出现失效现象,需要重新测定验证,因此综上所述,选用 Charm 检测试剂盒进行进一步定性方法性能指标的确证.
2.2 定性方法性能指标的确证
相比于国产快速检测试纸条,Charm 试剂盒检出限与国家标准一致, 均为4 U/mL, 且假阳性率仅为2%,在实际检测中具备更高的实用性,因此选用 Charm 试剂盒的测定结果进行定性方法性能指标的分析,Charm试剂盒与参比方法的 150 批乳制品测定结果通过统计学处理,差异无统计学意义（卡方检验：x 2 等于1.34,P ＞ 0.05）,根据评价方法,Charm 试剂盒检测 β- 内酰胺酶的灵敏度为 100%,特异性为 97.8%,其灵敏度及特异性均达到试剂盒快速筛查检测要求；与国家指定方法的符合率（即相对准确度）为 98%,Youden 指数为 0.978,说明 Charm 试剂盒与国家指定方法有较好的相关性和一致性,对于乳及乳制品的检测能够基本满足大批量筛选的要求.
3 讨论
国家指定方法杯碟法属于微生物检测方法,本方法对实验操作者有较高要求, 准备工作较多, 耗时较长,对于实验条件要求严格.
Charm β-内酰胺酶检测试剂盒采用竞争性配体-受体免疫法,利用 β- 内酰胺酶可分解乳及乳制品中的β- 内酰胺类抗生素的原理,通过快速测定与 β- 内酰胺酶反应后残留的青霉素 G 含量,从而快速检测乳及乳制品中 β- 内酰胺酶残留量.此试剂盒可快速检测到牛奶样品中残留的 β- 内酰胺酶,灵敏度高,标称检测限为 4 U/mL,与国家指定方法杯碟法的要求一致,且检出率无特异性差异,与国家指定方法的测定结果有较好的一致性,综上所述,杯碟法和 Charm 检测试剂盒法两种检测方法均可用于检测牛奶中 β- 内酰胺酶含量,在实际检测过程中,需要检测大批量样品时可根据实际情况选择检测方法,以近期食药总局出台的评价技术规范作为依据, 填补了试剂盒评价的空白,提供了试剂盒法快速筛查的理论依据,可选用 Charm检测试剂盒法作为快速、准确、可靠的检测方法预先筛查大批量样品,出现阳性样品时需要采用杯蝶法进行进一步确证.
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