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生物素对蛋鸡代谢基因表达的调控与日粮推荐用量
摘 要：生物素是蛋鸡正常生长发育和维持高产性能的必需营养素,作为蛋鸡体内重要生物代谢酶的辅助因子在蛋鸡营养物质代谢和细胞因子基因表达调控起着广泛而又非常关键的作用,是蛋鸡蛋白质、碳水化合物和脂肪代谢等必不可少的微量营养素.随着蛋鸡育种和集约化养殖设施设备的迅猛发展,蛋鸡日粮中生物素的营养需要量不断增高,目前推荐集约化高产蛋鸡配合饲料中生物素的添加量为150~250mg/t.
关键词：生物素；蛋鸡；基因表达；用量
中图分类号：S831.5 文献标识码：A 文章编号：1008-6137（2017）06-0006-05
0 引言
生物素(biotin),又称维生素H、辅酶R、维生素B7,属B族水溶性维生素.生物素是蛋鸡蛋白质、碳水化合物和脂肪等正常代谢不可或缺的物质,是蛋鸡生长发育和维持高产性能的必需营养素[1].近年来,生物素已成为蛋鸡维生素营养研究领域的热点.
早在1936年,两位德国科学家Kogl和Tonnis就从鸭蛋黄中分离提取出一种酵母生长所必需的结晶物质,称之为生物素.20世纪40年代初,欧美科学家分别明确了生物素的化学结构,1944年Harris等完成了生物素的人工化学合成.生物素广泛分布于动植物中,天然存在的生物素主要以与其它分子结合的形式存在.生物素的化学结构中包括一个含五个碳原子的羧基侧链和两个五元杂环,在体内由侧链上的羧基与酶蛋白的赖氨酸残基结合,发挥辅酶作用.生物素有8种不同的异构体,其中只有D-生物素具有生物活性.生物素在动物肝、肾、酵母（2mg/kg）及牛乳中含量较多.生物素容易同鸡蛋清中一种蛋白质（抗生物素蛋白,idin）结合,大量食用生蛋白可阻碍生物素的吸收导致生物素缺乏症,如体重减轻、脱毛、皮炎、脚趾开裂、蹄病等.生物素在蛋白质、脂肪合成、糖质新生等生化反应过程中均有重要作用.生物素是多种羧化酶的辅酶,在羧化酶反应中起CO2载体的作用,是生物体固定CO2的重要因素.生物素是许多需要ATP羧化反应中羧基的载体.羧基与生物素双环系统上的一个氮原子结合,如丙酮酸羧化酶催化丙酮酸羧化成草酰乙酸的反应.
生物素纯品为无色长针状结晶,具有尿素与噻吩相结合的骈环,并带有戊酸侧链.极微溶于水（22mg/100mL 水,25℃）和乙醇（80mg/100mL,25℃）,较易溶于热水和稀碱液,不溶于其它常见的有机溶剂.通常条件下生物素相当稳定,但强酸、强碱和甲醛可破坏生物素,酸败脂肪及胆碱也可使其失活,紫外线照射也能破坏生物素活性.生物素有结合和游离两种存在形式,结合的生物素不能被蛋鸡直接利用,必须在肠道经生物素降解酶分解,释放出游离生物素后,方能被吸收利用.生物素在小肠前段以完整分子形式与特异性载体结合被肠黏膜上皮细胞主动转运吸收,吸收后的生物素进入肝门脉循环,体内各种组织中以肝脏和肾脏中含量最高[3].蛋鸡通常不能降解生物素分子中的环结构,大部分在线粒体中通过侧链的β氧化降解为双降生物素,与体内多余的生物素一起随尿液排出.至于小肠内未被吸收的生物素以及肠道远端微生物自身合成的生物素,到了大肠部位也通过与小肠相类似的机理被机体吸收[2].
上世纪90年代以前,国际生物素市场一直由包括德国巴斯夫、瑞士罗氏、日本住友株式会社和武田化学等几家大公司所垄断.自1949年罗氏集团采用Sternbach 合成法,在世界首次实现D-生物素工业化合成生产以来,各国化学家对生物素合成方法开展了大量的研究,但作为工业化合成生产路线,均无明显进展.Sternbach法工业化生产中存在着硫代反应不完全、反应条件苛刻、原料难获取、成本高,脱苄收率低等弊端.多年来各国科学家虽试图改进该方法,但进展缓慢.为找出一条生产成本低、产品收率高的D-生物素合成新路径,复旦大学陈芬儿教授课题组独辟蹊径,刻苦攻关,终于在2001年开发成功以不对称催化合成为核心技术的D-生物素不对称合成新工艺.该技术以富马酸为起始原料,经氯代、相转移催化苄胺化和关环制得环酸,经脱水、不对称甲酯化、还原和硫得关键手性合成硫内酯,再经格式反应、羧化、脱水、立体专一性还原成D-双苄生物素,进而经脱苄、开环、再关环即得D-生物素.新的生物素工业化合成技术,原料易得且低廉,反应条件温和,生物素产品生产成本不到国外公司的三分之一.这一生物素合成新工艺,结束了我国生物素长期依赖进口的局面,并牢牢确立了我国生物素产品在国际市场上的话语权,使我国一举成为全球最大的生物素生产国和出口国.
1 生物素对蛋鸡营养代谢和细胞因子基因表达的调控
生物素对蛋鸡营养代谢基因表达的调控,主要是通过作为多种营养代谢酶辅助因子来实现的.生物素是羧化和羧基转移酶系的辅酶,是羧基转运的载体,这些酶系在蛋鸡体内有转移羧基和固定二氧化碳的作用.其中乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、丙酮酸羧化酶(PC)、丙酰辅酶A羧化酶(PCC)和3-丁烯酰辅酶A羧化酶(MCC)是四种代表性的羧化酶.随着基因调控和分子生物技术的发展,人们发现生物素不仅具有这些传统典型的酶辅助因子功能,而且还在转录和翻译水平上影响蛋鸡营养代谢基因的表达,实现对相关营养代谢的调控.
1.1 对蛋白质和核酸代谢基因表达的调控
生物素在蛋白质合成、氨基酸脱氨、氨基甲酞转移以及亮氨酸、色氨酸分解代谢中起重要的作用,也是多种氨基酸转移脱羧过程所必需.生物素缺乏会影响亮氨酸转化为草酰乙酸的脱氨反应,体内瓜氨酸合成鸟氨酸能力降低,,氨基酸结合进入肝脏、肠粘膜、胰腺和皮肤等组织蛋白质的过程被明显抑制.若及时补充生物素,便能促进氨基酸的结合.生物素缺乏会损害组蛋白与DNA的互作,这与组蛋白的磷酸化、乙酰化和化等作用有关.生物素缺乏还会导致肝脏鸟氨酸转甲氨酰酶活性及其mRNA丰度降低,鸟氨酸转甲氨酰酶在精氨酸代谢和尿素循环中起着很重要的作用.DNA芯片研究表明,生物素对外周血液单核细胞的多个基因表达均有影响.生物素酰腺苷酸是羧化全酶合成过程中的中间产物,生物素酰腺苷酸的合成是由羧化全酶合成酶催化的.目前认为生物素酰腺苷酸是通过一种尚不清楚的机理对可溶性鸟苷酸环化酶进行活化.鸟苷酸环化酶的活化使环鸟苷酸量增加,从而刺激蛋白激酶G产生信号传导,蛋白磷酸化得到活化,使编码羧化全酶合成酶、乙酰辅酶A羧化酶,丙酰辅酶A羧化酶基因转录活性增强.如果生物素缺乏或羧化全酶合成酶的活性降低这些基因的转录活性将受损.
生物素对嘌呤等核苷酸的合成也起着关键的作用.生物素缺乏将会损害组蛋白和DNA的互作,这与组蛋白的磷酸化、乙酰化和化等有关.生物素放射性标记后发现位于细胞核内的生物素与组蛋白共价形成核蛋白,并通过磷酸化,化来调控转录,基因沉默和DNA修复等代谢过程.
1.2 对碳水化合物代谢基因表达的调控
在碳水化合物代谢中,生物素酶完成脱羧和羧化反应.这些反应包括：丙酮酸向草酰乙酸的可逆转化,苹果酸转化成为丙酮酸,琥珀酸和丙酸的相互转化,草酰琥珀酸转化为α酮戊二酸以及脱羧作用的其它反应.生物素具有固定二氧化碳的生化作用.生物素缺乏降低了葡萄糖的利用率,糖酵解反应受阻,因为生物素是糖酵解过程中葡萄糖激酶、磷酸果糖激酶、丙酮酸激酶活性激活的关键因子.而生物素通过诱导胰岛素分泌进行碳水化合物代谢调节的机制主要有两条途径：一是生物素一葡萄糖激酶通路.葡萄糖激酶作为糖酵解过程核心酶之一,促进糖酵解反应生成丙酮酸.在丙酮酸脱氢酶的作用下,生成乙酰辅酶A,进入三羧酸循环,生成ATP来影响胰岛素的分泌,葡萄糖激酶活性在转录和翻译水平得到调控.生物素主要在转录阶段调控其表达,并对葡萄糖激酶mRNA的表达呈现出双向调节作用,即生物素短期作用产生刺激作用,长期作用则呈现抑制作用.但生物素通过葡萄糖激酶促进胰岛素分泌,只在生物素灌流的初期发生.通过第二信使鸟苷酸环化酶(cGMP)激活cGMP 依赖性的蛋白激酶,增加葡萄糖激酶mRNA的转录表达需要2h,而6 h后葡萄糖激酶活性才呈现大幅度提高.二是生物素一丙酮酸羧化酶通路.丙酮酸羧化酶作为依赖生物素羧化酶系之一,在糖异生和三羧酸循环过程中有重要作用.丙酮酸羧化酶在胰小岛里并没有发挥糖异生的作用,因其中磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶的mRNA的表达及酶的活性很低甚至没有,生物素同时也能大大降低其他组织中烯醇式丙酮酸羧激酶的活性,而磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶是糖异生过程不可或缺的关键酶之一,所以丙酮酸羧化酶催化生成的草酰乙酸只能进入三羧酸循环,从而产生大量的ATP.随着ATP,ADP能量状态的改变,激活细胞能量压力感受器5-AMP激活性蛋白激酶,通过一系列的转录因子SREBP-lc、ChREBP、NAMPT、PGC-ld和mTORCl等来调控碳水化合物的代谢.对于离体培养的非生物素缺乏小鼠胰岛细胞,10～1000nmol/L的生物素可以增加葡萄糖激酶活性和其mRNA丰度；同时胰岛素的表达和分泌随生物素的添加而提高.相反,生物素缺乏,胰脏葡萄糖激酶活性和mRNA的丰度降低至对照组的一半.中间代谢中另一个重要的蛋白质——胰岛素受体也受生物素的调节.有研究发现生物素在转录后提高了胰岛素受体水平.
1.3 对脂肪代谢基因表达的调控
在脂肪代谢中,乙酰辅酶A羧化酶催化乙酰辅酶A的羧化,其前体为丙二酰辅酶A,这一化合物的作用是能使脂肪酸链延长,随后由细胞多酶复合体和脂肪酸合成酶将丙二酰辅酶A合成棕榈酸.生物素也是合成长链不饱和脂肪酸的必须因子,并与胆固醇的代谢有关.脂肪代谢过程中需要乙酰辅酶A 羧化酶(ACC)、脂肪合成酶(FAS）、6-磷酸葡萄糖脱氢酶以及硬脂酰脱氢酶等重要酶的参与.而这些酶mRNA表达受到转录因子同醇调节元件结合蛋白(SREBPlc)调控.在脂肪合成代谢中,生物素通过SREBPlc激活乙酰辅酶A羧化酶,加速脂肪合成.而作为脂酸合成的限速酶,乙酰辅酶A羧化酶负反馈降低线粒体内脂酰肉碱转移酶的活性,抑制脂肪氧化分解.同时也激活6-磷酸葡糖脱氢酶和硬脂酰脱氢酶,促进不饱和脂肪酸的合成和脂肪细胞生长.葡萄糖是脂肪合成最主要的底物,因此参与糖酵解的酶也可被看作是脂肪合成代谢的延伸.生物素一定程度上提高了糖酵解过程中葡萄糖激酶的活性,同时生物素通过刺激胰岛素的分泌,激活葡萄糖载体转运葡萄糖进质膜,协同葡萄糖磷酸化.葡萄糖磷酸化生成葡萄糖-6磷酸刺激了ACC和FAS mRNA的表达,从而促进脂肪的合成.在脂肪分解代谢中,人们发现F0X01基因能抑制糖酵解和脂肪合成相关基因的表达.肝细胞中过氧化物酶增殖体受体抑制脂肪氧化和生酮作用,有利于脂肪合成酶和硬脂酰脱氢酶的合成.生物素衍生物抑制了过氧化物酶增殖体受体mRNA在脂肪组织中的表达及脂肪的生成,但生物素在不同组织中对过氧化物酶增殖体受体表达可能有所不同.生物素作为乙酰辅酶A羧化酶的辅酶参与脂肪酸的合成,催化乙酰CoA生成丙二酸CoA.该反应为脂肪酸合成的第一步,然后经过细胞质多酶复合体、脂肪酸合成酶,由丙二酰一CoA合成棕榈酸.在脂肪酸碳链的延长反应中,丙二酰-ACP作为二碳单位的供给体参与反应,而丙二酰-ACP来源于丙二酰CoA.生物素缺乏,脂类代谢异常,引起机体的脂肪酸组成发生变化,饱和脂肪酸合成减少,三酰甘油合成增多,使肝、肾脂肪提高.蛋鸡日粮缺乏生物素,会使肝脏组织中棕榈酸去饱和作用速率提高,棕榈油酸增加,硬脂酸减少.生物素也是长链不饱和脂肪酸正常合成和脂肪酸代谢的必需物质.生物素还与乙酰胆碱的合成和胆固醇的代谢有关,缺乏生物素会降低蛋鸡从亚油酸合成花生四烯酸的能力,导致亚油酸在体内累积.研究发现生物素和血清总脂、游离脂肪酸、甘油三酯和胆固醇负相关,和总磷脂浓度正相关.生物素具有降低血脂和胆固醇的作用,医学上用于治疗高甘油三酯血症等疾病；高剂量的生物素能降低血清中甘油三脂和极低密度脂蛋白,但总胆固醇浓度不受影响.生物素对脂肪酸的组成也有重要影响.生物素能提高脂肪酸的去饱和速率,添加生物素有利于亚麻油酸和花生四烯酸的生成,减少了硬脂肪的含量.生物素缺乏时去饱和酶活性降低,不饱和脂肪酸合成减少.
1.4 对细胞因子基因表达的调控
生物素可以在基因转录水平影响一些细胞因子的基因表达.添加生物素可以促进蛋鸡脾脏细胞IFN-y和IL基因的表达,显著提高其表达产物mRNA的表达水平[4].受生物素影响的这些细胞因子在免疫功能中非常重要.如干扰素具有广谱、间接非特异性的抗病毒活性,可诱导抗病毒基因如腺嘌呤核苷酸等的表达.IL-2可活化CD4和CD8 T细胞,促进细胞因子产生.刺激NK细胞增殖、活化,诱导LAK细胞产生.促进B细胞活化、增殖及产生抗体,激活单核一巨噬细胞系统.具有显著的抗肿瘤作用,并能抵抗病毒性感染.IL-1 使Th淋巴细胞活化成熟,使B淋巴细胞克隆扩增,激活NK细胞,在炎症反应中结合巨噬细胞和中性粒细胞.另外,IL-1 还诱导肝细胞合成急性期蛋白、成骨细胞增殖及成骨细胞,产生前列腺素.IL一4可介导B淋巴细胞的激活和B淋巴细胞的类别转换.添加生物素可显著提高增殖细胞核抗原基因的表达水平,显著提高血液中B淋巴细胞的转化效率,以及脾脏中T淋巴细胞和B淋巴细胞的转化效率[5].生物素缺乏将降低蛋鸡免疫器官中的DNA含量和DNA的周转代谢速度.添加生物素,能明显提高免疫器官的DNA含量,促进DNA的周转代谢.
1.5 对其它营养物代谢基因表达的调控
生物素作为辅酶成分还参与其它微量营养素营养代谢的基因表达调控,包括维生素B6、维生素B12、维生素C、叶酸、泛酸代谢以及溶菌酶的活化等.除此之外,生物素对角蛋白合成和表皮细胞增值分化的基因表达过程也有着极为重要的作用,能够促进角质生成,影响表皮细胞的增值和分化,可有效预防蛋鸡脚趾开裂出血以及皮炎、脱毛等病症的发病率.
2 生物素在蛋鸡日粮中的推荐用量
由于生物素在饲料原料中广泛分布,而且蛋鸡肠道微生物能够合成生物素,过去人们曾认为蛋鸡饲料中无需额外添加.随着蛋鸡育种和集约化养殖设备与环境的迅猛发展和变化,生物素对蛋鸡基因表达调控的影响日趋重要.美国NRC和世界著名动物维生素营养研究机构,近年来均对蛋鸡生物素营养需要量进行上调.美国NRC推荐蛋鸡生物素添加量为100~150mg／t,帝斯曼公司OVN（2016版）蛋鸡饲料生物素的推荐剂量为100~150mg／t,泰高公司（2016版）蛋鸡饲料生物素的推荐剂量为120~150mg／t.另外,笔者统计了国内外畜牧行业期刊（2000~2016年）共计93篇有关蛋鸡维生素营养论文中蛋鸡配合饲料的生物素使用量,经过计算求得其平均值为112mg／t,整体水平偏低.目前,对于集约化养殖的高产蛋鸡品种,建议采用我国农业部《饲料添加剂安全使用规范》的推荐用量150-250mg／t.
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