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双翅目昆虫侵袭对荷斯坦奶牛内分泌与免疫机能的影响
摘 要：本试验旨在研究在双翅目昆虫嚣张期,双翅目昆虫侵袭对荷斯坦奶牛内分泌及免疫力的影响.试验选取9头健康荷斯坦奶牛,采用酶联免疫吸附（ELISA）法对奶牛内分泌激素进行测定；采用流式细胞仪对外周血液CD3+、CD4+、CD8+T和CD21+B淋巴细胞进行测定.结果表明：奶牛血清中促肾上腺皮质激素、生长激素和催乳素含量均为6月最高、7月最低,差异显著（P＜0.05）；去甲肾上腺素含量7月最高,6月最低,差异显著（P＜0.05）.血液中CD3+T淋巴细胞百分率和CD4+T淋巴细胞百分率6月显著高于7月（P＜0.05）；CD8+T淋巴细胞百分率7月与8月差异显著（P＜0.05）；CD21+B淋巴细胞百分率6月与9月差异显著（P＜0.05）.结果说明,在双翅目昆虫活动期,双翅目昆虫侵袭时荷斯坦奶牛内分泌激素水平和免疫功能均受到影响.
关键词：双翅目昆虫；荷斯坦奶牛；应激；内分泌；免疫力
内蒙古是一个奶牛生产地带,近几年来奶牛的数量不断增长,使奶牛生存的环境卫生日益恶化.常年发生蚊和蝇等双翅目昆虫的侵袭,诱发奶牛应激反应,导致神经内分泌紊乱、免疫力下降和重大疾病流行,使奶牛业的发展受到很大制约[1].
双翅目昆虫作为奶牛场中的主要应激源,侵袭强度过大或作用时间过长时,奶牛机体就会逐渐失去应付能力,出现病理状态.当机体遭遇冷、热和饥饿刺激时,会同时引起交感神经系统和肾上腺机能增强,表现出交感-肾上腺髓质系统亢进,髓质分泌大量肾上腺素（E）和去甲肾上腺素（NE）,引起应激反应[2.3].有研究表明,奶牛受到长时间的冷热应激后,血清中促肾上腺皮质激素（ACTH）和皮质醇（COR）含量与非应激期相比无显著性差异,甚至有低于非应激期的趋势[4].大多数研究认为,应激对免疫系统有抑制作用,应激和免疫之间的关系还受性别、年龄和心理因素等个体因素影响[5].应激时,机体在神经-内分泌-免疫系统协同作用下,进行一系列的免疫调节[6].所以,应激影响神经-内分泌-免疫网络.
本试验通过研究奶牛受到双翅目昆虫的侵袭时,奶牛内分泌激素及免疫力的变化规律,论证双翅目昆虫侵袭时奶牛的应激反应.为进一步缓解昆虫对奶牛应激的技术措施提供理论依据.
1材料
（1）试验动物及管理.按胎次、产奶量和年龄相近的原则,以舍饲奶牛场饲养的9头健康荷斯坦奶牛作为试验对象.牛群挤奶时间为上午5∶30,下午17∶30,日挤奶2次.饲料给予时间为上午7∶00～9∶00,中午13∶30～15∶30,晚上19∶00～21∶00,共3次.自由采食青干草和饮水.其余时间牛在运动场自由活动或休息.
（2）血样的采集与预处理.每个试验月采1次血液样品,在双翅目昆虫活动最频繁的时间段,用普通真空采血管和抗凝真空采血管颈静脉采集血样,离心分离血清和血浆,带回实验室-20℃保存待检测.
（3）主要试剂.一抗：CD3MoabAsciteluidIgG1isotype；CD4MoAbAsciteluidIgG1isotype；
CD8MoAbAsciteluidIgMisotype；CD21MoabAsciteluidIgMisotype.二抗：Fluorescein(Fitc)AntiMouseIgM；GoatAntiMouseIgG1,IlumanadsFITC（一抗与二抗都是POBox502,Pullman,WA99163USA公司提供）.
（4）试验器材.离心机（型号为Multifuge）购自美国ThermoScientificHeraeus公司,酶标仪（型号为ThermoNANODROP2000c）购自美国ThermoScientificHeraeus公司,恒温生化培养箱（型号为ZXSD-B1090）购自上海智城公司,流式细胞仪(型号为FACSSalibur)购自美国BD公司,移液（型号为TopPette）购自北京大龙兴创实验仪器有限公司.
2方法
（1）双翅目昆虫侵袭时奶牛内分泌激素水平的影响.采用酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒法,测定血清中的内分泌激素相关指标.测定的激素指标为促肾上腺皮质激素（ACTH）、生长激素(GH）、皮质醇（COR）、泌乳素（PRL）和去甲肾上腺素（NE）,试验步骤按照ELISA试剂盒说明书进行.试剂盒均购自北京城林生物科技有限公司.
（2）双翅目昆虫侵袭时对奶牛免疫机能的影响.采用流式细胞仪测定奶牛外周血淋巴细胞及其亚群的影响.
测定方法：每个管中用移液器移取40uL抗凝血,迅速加入10倍稀释后的800uL溶血素,轻轻震匀,静置12分钟,1500rpm离心400秒,弃上清；加入300μＬPBS缓冲溶液,清洗2次,离心后弃上清；加入200uLPBS稀释,然后按(50uL/份)分成4等份,分别加入淋巴细胞荧光标记CD3/FITC-IgG1、CD4/FITC-IgG1、CD8/FITC-IgM和CD21/FITC-IgM,避光低温孵育30分钟后离心弃上清,再加入200uLPBS,漩涡震荡使细胞悬浮,流式细胞仪上获取10000个细胞,检测其中CD3+T、CD4+T、CD8+T和CD21+B细胞的所占百分数.
（3）统计学分析.采用Excel和SAS9.0软件对数据进行统计分析,试验数据用“平均值&plun;标准差”表示.使用方差分析对试验结果进行显著性分析,P＜0.05表示差异显著,P＜0.01表示差异极显著,P＞0.05表示差异不显著.
3结果与分析
（1）双翅目昆虫侵袭时对奶牛内分泌激素水平的影响.双翅目昆虫侵袭对奶牛血清激素水平的影响见表1.从表1可见,双翅目昆虫活动期,奶牛血清中的ACTH含量6月极显著高于7月,显著高于8月和9月,6月和10月间无显著差异（P＞0.05）；血清中COR含量各试验月间差异显著（P＜0.05）,但是从6月以后,至7月和8月份有下降趋势,9月开始回升；血清中GH含量6月极显著高于7月和8月,显著高于9月,但与10月差异不显著（P＞0.05）；血清中PRL含量6月显著高于7月和8月（P＜0.05）,但是9月和10月无明显差异（P＞0.05）；血清中NE含量7月显著高于6月、9月和10月（P＜0.05）,与8月间差异不显著（P＞0.05）.
（2）奶牛血液淋巴细胞的变化.奶牛血液中淋巴细胞（%）水平见表2,奶牛血液淋巴细胞（%）分析图见图1~图4.由表2可知,双翅目昆虫的侵袭对荷斯坦奶牛血液CD3+T淋巴细胞（%）水平的影响规律是从6月74.63&plun;7.21％显著下降至7月55.29&plun;1.76％,一直持续到10月50.82&plun;1.49％的水平（P＜0.05）；血液CD4+T淋巴细胞（%）水平的影响规律是从6月59.21&plun;2.10％显著下降至7月40.75&plun;2.14％,一直持续到10月33.87&plun;3.46％的水平（P＜0.05）；血液CD8+T淋巴细胞（%）水平的影响规律是从6月13.05&plun;0.89％显著提高至7月35.73&plun;1.14％,一直持续到9月21.09&plun;1.19％的水平（P＜0.05）,10月下降至15.07&plun;1.65％,与6月相比差异不显著（P＞0.05）；奶牛血液CD21+B淋巴细胞（%）水平的影响规律是从6月29.44&plun;1.22％显著下降至8月23.64&plun;1.59％,而从9月显著提高至34.45&plun;2.15％的水平（P＜0.05）,持续至10月.
4讨论
（1）双翅目昆虫侵袭对荷斯坦奶牛血液内分泌激素水平的影响.应激时糖皮质激素的分泌加强是通过下丘脑-垂体前叶-肾上腺皮质轴（HPA）相互作用而实现的.大量研究表明,机体发生急性应激反应时增高HPA轴兴奋性,从而促进ACTH释放,引起长时间的皮质醇水平升高,使有生物学活性的游离皮质醇有充分的时间作用于靶器官,增强或抑制靶器官的功能[7].但是随着应激时间的延长,皮质醇浓度会逐渐降低,甚至低于基础浓度,说明皮质醇的合成在逐渐减少.皮质醇在体内参与机体的应激反应,并调节三大代谢,是维持许多组织器官正常活动所必需的,具有抗炎和抗免疫等作用[8-9].西伯利亚鲟热应激初期时血清皮质醇含量迅速升高,之后快速回落[10].本试验结果表明,双翅目昆虫开始侵袭的6月,奶牛血清中ACTH和COR水平较高,而在双翅目昆虫频繁侵袭的7月,奶牛血清中ACTH和COR水平下降,一直持续至9月,与上述研究结果较一致.由此认为,在双翅目昆虫活动期,特别是双翅目昆虫频繁侵袭奶牛时期,对奶牛内分泌产生一定的影响,长期昆虫侵袭产生的应激反应对奶牛血清中ACTH和COR的水平具有抑制作用.
GH主要的生理功能是促进物质代谢和生长发育,还参与机体的应激反应.运动、饥饿及应激侵袭均可引起GH分泌增多.PRL主要的生理作用是促进乳腺的发育并维持泌乳.应激状态下,血液中PRL与ACTH和GH的浓度同时增加,共同参与应激反应.吕晓伟[4]的研究表明,冷热应激期间奶牛血清中GH和PRL的含量显著低于非应激期.本试验结果也证实,双翅目昆虫开始侵袭的6月,奶牛血清中GH和PRL水平较高,在双翅目昆虫频繁侵袭的7月,奶牛血清中GH和PRL水平下降,一直持续至9月.由此认为,在双翅目昆虫活动季节,特别是双翅目昆虫频繁侵袭奶牛时,对奶牛内分泌产生一定的影响,长期昆虫侵袭产生的应激反应对奶牛血清中GH和PRL的水平具有抑制作用.当机体受到强烈侵袭时,就会出现以交感神经兴奋、儿茶酚胺分泌增多的一系列神经内分泌反应,以适应强烈侵袭,提高机体抗病的能力.应激可以促使交感神经和肾上腺髓质活动的加强,使血液中NE水平升高[11].本试验结果表明,在双翅目昆虫频繁侵袭的7月和8月,奶牛血清中NE水平明显提高,9月开始下降.由此推测为,在双翅目昆虫频繁侵袭奶牛期间,昆虫侵袭产生的应激反应对奶牛血清中NE水平具有促进作用.
（2）双翅目昆虫侵袭对奶牛细胞免疫及体液免疫力的影响.研究者认为,一些动物实验及人体观察证实,长期冷应激对免疫功能的影响主要是抑制性的[6].目前已知CD3分子能够表达于全部T细胞上,是T细胞共同的表面标志,因此它是鉴定T细胞的重要标记,CD3+T淋巴细胞降低提示细胞免疫机能降低或受抑制.CD4存在于辅助性T细胞表面,CD8存在于细胞毒性T细胞表面.CD4+T细胞含量高时,当外源性病原微生物侵入体内时能够很快启动免疫反应,从而抵抗病原,表明机体免疫功能强,不易被疾病感染.CD8+T细胞含量高时,能识别被感染的细胞越多,表明机体本身的免疫功能降低,需要外来疫苗来抵抗病原.CD21+B淋巴细胞代表机体体液免疫力的强弱,CD21+B淋巴细胞降低,机体体液免疫力下降或受到抑制.应激侵袭可降低大鼠血液中CD3和CD4细胞的百分率,而CD8百分率提高,说明产生应激时大鼠细胞免疫功能降低[12].慢性冷热应激期CD3+T淋巴细胞（%）和CD21+B淋巴细胞（%）都显著降低,使奶牛的免疫能力下降[13].本研究结果表明,在双翅目昆虫活动季节,双翅目昆虫的侵袭对奶牛血液CD3+T、CD4+T和CD21+B淋巴细胞（%）水平的影响是从6月的最高下降至7月和8月的最低值,CD3+T和CD4+T一直持续到10月.同时,双翅目昆虫的侵袭对奶牛血液CD8+T淋巴细胞（%）水平的影响是从6月提高至7月的最高值,持续到8月.由此认为,CD3+T和CD4+T淋巴细胞降低表明双翅目昆虫的侵袭,会降低或抑制奶牛细胞免疫机能.CD8+T细胞含量的提高,能识别被感染的细胞越多,表明双翅目昆虫的侵袭,降低奶牛机体本身的免疫功能,需要疫苗来抵抗病原.CD21+B淋巴细胞降低表明双翅目昆虫的侵袭,能降低或抑制奶牛机体体液免疫力.
综上所述,在双翅目昆虫活动期,特别是双翅目昆虫频繁侵袭奶牛时期,对奶牛HPA轴产生一定的影响.而且长期昆虫侵袭产生的应激反应对奶牛血清中ACTH、COR、GH和PRL的水平具有抑制作用,而对奶牛血清中NE水平具有促进作用.双翅目昆虫的侵袭,能够降低或抑制奶牛细胞免疫机能及体液免疫力.同时降低奶牛机体本身的免疫功能,需要疫苗来抵抗病原.
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