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脲酶菌的筛选与其对垃圾焚烧飞灰的固化
摘 要: 焚烧是当前城市垃圾处置的重要方式,焚烧飞灰及其重金属却是威胁周围环境的一种污染源.为降低这种污染,从植物根际筛选获得高活性脲酶菌,并比较脲酶菌固化焚烧飞灰后的抗压强度、颗粒级配及重金属稳定化效果.结果表明：从丹参根际土壤内分离获得2株高效脲酶菌Bacillus aryabhattai UR-F51和Pseudomonas taiwanensis UR-121；将脲酶菌与飞灰按一定比例混合后固化,菌株UR-F51和UR-121使固化飞灰的抗压强度分别增加48.00%和27.00%,固化颗粒粒径增加10.00%~145.00%；飞灰中重金属（Cr、Ni、Cu、Cd、Hg和Pb）的固化率分别为15.27%~37.23%、41.49%~90.43%、37.17%~99.73%、42.86%~71.42%、20.00%~40.00%和47.06%~82.35%.脲酶菌可显著提升飞灰及其重金属的固化效果,菌株UR-F51的固化效果最好,为缓解城市生活垃圾焚烧飞灰污染提供一种新途径.
关键词： 垃圾焚烧；飞灰；重金属；脲酶菌；固化
中图分类号： 2939.99
文献标志码： A
文章编号： 1673-3851 (2018) 11-0746-06
0引言
垃圾焚烧是当前城市垃圾处置的重要方式.近年来,我国经济发达地区兴建生活垃圾焚烧厂的量逐年递增,2015年底全国生活垃圾焚烧厂多达267座,日焚烧垃圾21.90万吨以上,且年焚烧垃圾量以10%的速度增长［1］.灰渣是生活垃圾焚烧的必然产物,其中包括焚烧炉中产生的底灰和烟气净化系统中收集得到的飞灰,底灰的比重约为20.00%~30.00%,飞灰比重约为3.00%~5.00%［2］.大量研究结果表明,飞灰中易富集Zn、Pb、Hg、Cu、Cr、Cd和Ni等重金属,飞灰内Zn、Pb、Cu、Cr、Cd和Ni含量一般占飞灰干重的0.41%~1.93%、0.14%~0.57%、0.04%~0.11%、0.02%~0.04%、0.01%~0.04%和0.01%~0.02%［3-6］.
飞灰由于富含重金属有毒有害物质,需加以特殊处理.目前垃圾焚烧飞灰固化/稳定化处理方法主要有四种［7］：高温处理、水泥处理、化学药剂处理、水泥-化学药剂复合处理.这四种处理均有各自的优点,但都存在成本高和不环保等缺点.近年来,利用微生物诱导碳酸盐沉积技术在重金属固化方面具有极大潜力［8］.目前常用的微生物主要包括产脲酶细菌、脱氮细菌和硫酸盐还原菌等,其中脲酶细菌因能够高效诱导碳酸盐沉积而被广泛应用［9］.脲酶菌具有持续分解尿素的功能,致使NH3和CO2-3不断释放.同时,NH3的释放,会促使溶液pH值升高,进而提高CO2-3的浓度,最终达到固化重金属的效果［10］.目前研究的脲酶菌主要有Bacillus、Methylocystis和Sporosarcina等细菌,其中Sporosarcina pasteurii菌株应用最为广泛［11］.但是,除González报导Sporosarcina pasteurii对飞灰的固化效果外［12］,脲酶菌诱导碳酸盐沉积技术在飞灰固化应用方面有待进一步深入研究.
本文目的是研究脲酶菌对焚烧飞灰内重金属的固化效果.从丹参根际土壤中筛选获得两株脲酶菌UR-F51和UR-121,对固化飞灰的无侧限抗压强度和颗粒级配进行测定,从而评估脲酶菌UR-F51和UR-121对飞灰的固化能力；对固化后飞灰的重金属浸出浓度进行了测试,从而评估微生物诱导碳酸盐沉积处理后飞灰内重金属的稳定能力.
1材料与方法
1.1实验材料
KH2PO4 2.00 g/L,NaCl 5.00 g/L,Na2Ac 2.00 g/L,尿素20.00 g/L,琼脂20.00 g/L,酚红（终浓度为0.01 g/L）.
富集培养基：酵母提取物20.00 g/L,(NH4)2SO4 10.00 g/L.
筛选培养基：葡萄糖20.00 g/L,蛋白胨2.00 g/L,牛肉膏10.00 g/L,酵母膏3.00 g/L,所用试剂纯度皆为分析纯.城市垃圾焚烧飞灰来源于杭州市萧山区锦江绿色有限公司.
1.2实验方法
1.2.1脲酶菌的筛选与鉴定
脲酶菌的筛选：称取土壤5.00 g,按10%的接种量与无菌水混合,制成悬浮液.对悬浮液进行倍比稀释后,分别吸取100 μL的1×10-5、1×10-6倍和1×10-7倍稀释液,均匀涂布于固体筛选培养基上,每个梯度3个重复,30 ℃恒温培养,定期观察.然后,挑取使固体筛选培养基颜色变红的不同菌株,在固体筛选培养基上划线纯化培养,30 ℃恒温培养,每隔24 h观察.以尿素为底物,进行脲酶活性测定,具体方法见文献［13］.挑选脲酶活性较高的菌株进行飞灰固化实验.
脲酶菌分子鉴定：对筛选获得的高效脲酶菌进行16S rDNA分子鉴定.采用通用引物27 F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492 R（GGTTACCTTGTTACGACTT）对脲酶菌DNA进行PCR扩增,PCR反应体系和循环参数见文献［14］.PCR扩增产物进行纯化后,送至苏州金唯智生物科技有限公司测序.测序结果与Ezbiocloud库进行Blast比对,利用MEGA 5.0建立系统发育树,从而分析脲酶菌的进化地位.
1.2.2脲酶菌固化飞灰
1.2.2.1脲酶菌固化飞灰过程
将垃圾焚烧飞灰于105 ℃烘箱内干燥24 h；脲酶菌UR-F51和UR-121在30 ℃、220 r/min摇床内扩大培养48 h.将垃圾焚烧飞灰与尿素和菌液按1.00 kg：0.027 kg：300.00 mL的比例进行充分混合,称取上述混合物120.00 g,分三次均匀填充于内径36 mm、高80 mm的模具内,后置于温度为20 ℃、湿度为95%的养护箱内养护,24 h后开模,并继续在养护箱内养护6 d.以水处理后的飞灰样品为对照组,每组实验重复3次.
1.2.2.2固化飞灰的检测
无侧限抗压强度：利用万能伺服试验机（CMT4000）对养护7 d后的模型进行无侧限抗压试验.试验机压力计量程为30 kN,精度为1 N,加载速率为2 mm/min.
固化颗粒级配：取无侧限抗压实验后飞灰样品,在105 ℃的烘箱内烘干24 h,用橡胶槌研碎,按《土工试验规程》（SL237-1999）,采用筛分法和甲种密度计法联合测定颗粒级配,并绘制曲线,颗粒级配的数据处理和分析方法见文献［15］.
重金属的固化率：取无侧限抗压实验后样品,在105 ℃的烘箱内烘干24 h,用橡胶槌研碎,按《固体废物浸出毒性浸出方法-水平振荡法》（HJ 557-2009）,对脲酶菌固化后飞灰进行重金属毒性浸出,并利用ICP-MS技术对脲酶菌固化后飞灰重金属浸出浓度进行测定,计算固化飞灰的重金属固化率.
1.3统计分析
利用SPSS 20.0软件对实验数据进行处理分析.
2结果与分析
2.1脲酶菌筛选与鉴定
2.1.1脲酶活性测定
从土壤内筛选获得2株生长较快的脲酶菌,分别命名为UR-F51和UR-121.对2株脲酶菌进行脲酶活性定量检测,结果见表1.由表1可知,菌株UR-F51和UR-121的脲酶活性分别为14.91 mmol/L和10.19 mmol/L,且菌株UR-F51脲酶活性是UR-121的1.5倍.
2.1.2脲酶菌16S rDNA分子鉴定
对筛选获得的高效脲酶菌进行16S rDNA分子鉴定,并将脲酶菌测序结果与Ezbiocloud库进行比对,脲酶菌UR-121和UR-F51的分子鉴定与Ezbiocloud数据库比对结果,如表2.表2显示：菌株UR-F51与Bacillus aryabhattai、UR-121与Pseudomonas taiwanensis相似度均为99%以上.利用软件MEGA 5.0,建立脲酶菌UR-121和UR-F51的系统发育树,如图1.图1中可见,菌株UR-F51与Bacillus aryabhattai、菌株UR-121与Pseudomonas taiwanensis各自聚为一簇,因此菌株UR-F51为Bacillus aryabhattai,菌株UR-121为Pseudomonas taiwanensis.
2.2脲酶菌固化飞灰
利用脲酶菌UR-F51和UR-121分别固化垃圾焚烧飞灰,继而测定脲酶菌固化后飞灰的各项指标,即无侧限抗压强度、飞灰颗粒级配、飞灰颗粒SEM检测和重金属固化率.
2.2.1无侧限抗压强度
脲酶菌固化后飞灰样品在养护箱内养护7 d,然后测定其无侧限抗压强度.脲酶菌UR-F51和UR-121的无侧限抗压强度测定结果如图2所示.由图2可知,脲酶活性与抗压强度呈正相关,脲酶活性较高的UR-F51,其无侧限抗压强度相对其他处理组偏高；UR-F51和UR-121处理组的抗压强度分别为0.42 MPa和0.36 MPa,与对照组相比,分别提高48.46%和27.39%.以上结果表明,脲酶菌固化后飞灰的无侧限抗压强度明显得到提高,且与脲酶活性呈一定的正相关.
2.2.2固化飞灰颗粒级配
采用筛分法和甲种密度计法联合测定固化后飞灰的颗粒级配,并绘制颗粒级配曲线,脲酶菌UR-121和UR-F51固化后的飞灰颗分级配曲线,如图3.结果显示：脲酶菌固化飞灰的颗粒直径在0.00~1.00 mm之间；粒径小于0.01 mm时,处理组间无明显差异,且所有固化后的飞灰所占的百分含量均约为10%；粒径在0.03~0.90 mm之间时,处理组间差异显著,与对照相比,菌株UR-F51和UR-121处理组所占百分含量显著增偏高,且处理组UR-F51所占百分含量显著高于UR-121.以上结果表明：脲酶菌固化后飞灰的颗粒粒径显著变大,且处理组UR-F51的颗分粒径最大,与脲酶菌UR-F51和UR-121固化飞灰后的扫描电镜（图4）结果一致.
2.3.3固化飞灰的重金属固化率
脲酶菌UR-121和UR-F51固化飞灰后的重金属浸出浓度结果如表3所示.由表3可知,Cu和Cr的浸出浓度显著高于Ni、Cd、Hg和Pb.菌株UR-F51和UR-121处理组的Cr、Ni、Cu、Cd和Pb浸出浓度显著低于对照,表明2株脲酶菌显著促进飞灰中重金属的固化作用.菌株UR-F51和UR-121处理组固化后飞灰内Cu的浸出浓度分别为0.58 μg/L和132.70 μg/L,固化率分别为99.73%和37.17%；Ni浸出浓度分别为0.09 μg/L和0.55 μg/L,固化率分别为90.43%和41.49%；Cr浸出浓度分别为2.63 μg/L和3.55 μg/L,固化率分别为37.23%和15.27%.以上结果证实菌株UR-F51对飞灰重金属的固化效果最佳.
3讨论
本文从土壤中分离出2株脲酶菌Bacillus aryabhattai UR-F51和Pseudomonas taiwanensis UR-121,进一步分析发现2株脲酶菌均能增强飞灰的固化作用,其中菌株Bacillus aryabhattai UR-F51对飞灰及其重金属的固化效果最好,在飞灰处理中具有一定的应用潜力.影响飞灰及其重金属的因素有很多,如脲酶菌脲酶活性、环境pH值、脲酶菌代谢产物和飞灰颗粒大小等［8］.
脲酶菌的脲酶活性影响飞灰的固化效果.脲酶菌脲酶活性的高低,反映了对尿素分解能力的强弱.脲酶活性越强,分解尿素越多,产生的NH+4和CO2-3浓度越高,过饱和的CO2-3离子会促使金属离子的沉淀［16］.季斌等［11］在研究产脲酶微生物诱导钙沉淀及其工程应用时发现,脲酶活性和脲酶菌诱导的金属离子沉积呈正相关.可见,脲酶菌脲酶活性的强弱会影响重金属固化率的大小.pH值变化是影响脲酶菌固化飞灰内重金属的重要因素之一.pH值的增加,有利于HCO-3和CO2-3离子的生成,进而导致重金属离子的沉积［17］；较高pH环境下,细胞膜ζ电位为负值［18］,能与正电荷金属离子紧密结合.Zhu等［19］研究表明,一定范围内,pH值越高,胞壁上多糖、羧基、膦酸酯和胺和羟基等负官能团,结合正电荷金属离子的能力越强.因此,飞灰内金属离子的固化与pH值呈很好的相关性.脲酶菌的代谢产物可促进飞灰内金属离子的固化.脲酶菌有很多代谢产物,如胞外多糖、有机酸、氨基酸和碳水化合物等［20］.多糖可通过本身所带的负电荷官能团吸附溶液内游离的金属阳离子.Phillips等［21］证明,多糖可通过负电荷官能团(羧基、酰胺基、氨基和羟基)与金属阳离子结合,且与Pb、Cd、Cr和Hg的固定化呈正相关.另外,有机酸、氨基酸和碳水化合物等同样可改变环境pH值,进而影响飞灰内金属离子固化效果.González等［12］报道微生物分泌的有机化合物,如有机酸、氨基酸和碳水化合物等,通过结合、沉淀、改变环境pH值或微生物的氧化还原状态来影响金属的固定化.因此,脲酶菌产生的代谢产物通过自身负电荷官能团吸附正电荷金属离子或者改变环境pH值,从而增强飞灰及其金属离子的固化效应.飞灰粒径大小是影响脲酶菌固化飞灰内重金属的另一个重要因素.飞灰的颗粒直径越大,单位反应面积越小,则越难富集重金属,最终导致飞灰内重金属含量越低.Ajmonemarsan等［22］认为,相互粘结的两个细小颗粒间接触面积越大,则会产生更多的接触及吸附位点,最终颗粒表面会吸附更多重金属,且更加牢固；当细小颗粒相互粘结时所形成的紧密空隙,达到固化飞灰内重金属的效果.脲酶菌的脲酶活性、环境pH值、脲酶菌代谢产物等因素均显著影响脲酶菌对飞灰及其重金属的固化效果,菌株UR-F51对飞灰及其重金属的强固化活性可能与这几方面均相关.
4结论
飞灰富含重金属等有毒有害物质,对人类的健康造成极大的威胁.许多研究表明,脲酶菌的应用可以缓解城市生活垃圾焚烧飞灰污染.本文通过筛选脲酶菌,并探索脲酶菌生物固化焚烧飞灰的效果,结论如下：
a) 本文从土壤内分离获得2株高效脲酶菌Bacillus aryabhattai UR-F51和Pseudomonas taiwanensis UR-121.
b) 2株脲酶菌均能增强飞灰的固化作用,其中菌株Bacillus aryabhattai UR-F51对飞灰及其重金属的固化效果最好,在飞灰处理中具有一定的应用潜力.
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