病毒论文范文资料 与猪圆环病毒２型全基因组的克隆与病毒拯救有关论文如何写

这篇病毒论文范文为免费优秀学术论文范文,可用于相关写作参考。

猪圆环病毒２型全基因组的克隆与病毒拯救

摘 要: 为构建猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV) 2型(PCV2)感染性DNA克隆,以淋巴结病料组织中分离的PCV2细胞培养适应毒株为材料,通过基因序列分析比对,在PCV2基因组序列Xba Ⅰ酶切位点区设计重叠引物,进行全长扩增并克隆至pMD18T和pBluescript SK,获得载体pMDPCV2和pBluescript SKPCV2.将pMDPCV2重组质粒大量扩增后,用Xba Ⅰ切出PCV2全基因组,在体外用T4 DNA连接酶使其自环化.通过脂质体法将PCV2自环化产物转染至PK15细胞,并且经15次连续传代,分别用PCR、RTPCR和间接免疫荧光测定(Indirect immunofluorescence assay, IFA)检测到PCV2的复制、转录和蛋白表达.该研究成功构建具有感染性的PCV2全基因组DNA,为PCV2致病机理和基因功能研究奠定基础.

关键词： 猪圆环病毒2型；全长基因组克隆；细胞转染；病毒拯救

中图分类号： Q939.47

文献标志码： A

文章编号： 1673\|3851 (2018) 07\|0468\|06

0引言

猪圆环病毒(Porcine circovirus, PCV)是最小的动物DNA病毒之一［1］,最早由德国学者Tischer在猪肾细胞系PK15中被当作一种细胞污染物［2］,其病毒粒子主要以二十面体对称,无囊膜为主要特征,直径约17 nm.PCV基因组以滚环模式复制,大小约为1.7~2.0 kb,为单股环状闭合DNA.根据其核苷酸序列和致病性不同,PCV被分为PCV1、PCV2 和PCV3.PCV1无致病性,PCV3为新发现的一种猪圆环病毒,可能与垂直传播或导致母猪繁殖障碍疾病有关［35］.Allan等［6］从猪群中分离并确认PCV2为断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）的主要病原,其主要影响6~8周断奶仔猪,通常表现为消瘦、呼吸困难和免疫抑制［78］.PCV2还可诱导猪皮炎与肾炎,繁殖障碍和呼吸道综合征等疾病的综合感染［9］.

PCV基因组中大于200 nt的开放阅读框(Open reading frame, ORF)有6个［10］,已全部鉴定完毕.ORF1是其中最大的开放阅读框,编码启动病毒复制的Rep蛋白,为PCV2的DNA复制、相关蛋白表达及病毒粒子的产生所必需,不同PCV毒株ORF1的核苷酸同源性高达80%以上［11］；ORF2位于病毒基因组互补链,编码病毒的核衣壳蛋白Cap,是目前唯一已知的结构蛋白,不同PCV毒株的核苷酸同源性为63%左右［1213］.Cap蛋白具有免疫原性,存在多个免疫反应区,可诱导机体产生病毒中和抗体,是PCV2最重要的亚单位疫苗抗原［14］.ORF3编码一种非病毒复制必需的非结构蛋白,通过构建ORF3缺失株证实ORF3蛋白能导致PK15细胞凋亡的发生［15］,ORF4编码60个氨基酸,与ORF1和ORF3基因重叠,编码方向与ORF1相反,ORF4蛋白具有凋亡抑制功能但非病毒复制必需［1617］.ORF5可能通过调节NFκB信号通路在PCV2持续性感染中起重要作用［18］.PCV2的ORF6蛋白对病毒复制是非必需的,可能参与Caspase调控和多个细胞因子表达［19］.

目前,PCV2的分子致病机制尚未研究清楚.为进一步研究PCV2基因组结构与功能、致病机制和免疫机理,本文通过PCR扩增PCV2全基因组,构建自环化PCV2全基因组DNA,并进一步转染细胞,成功获得拯救病毒PCV2.

1材料与方法

1.1材料与试剂

1.1.1毒株与细胞

PCV2细胞株（PCV2SY）由扬州大学高崧教授提供；不携带PCV的PK15细胞由本实验室保存.

1.1.2载体与菌株

pMD18T连接试剂盒购于宝生物工程（大连）有限公司,大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α和pBluescript SK（pSK）载体由本实验室保存.

1.1.3试剂

Taq DNA聚合酶、dNTP、胶回收试剂盒、相关引物、DMEM高糖培养基均购自生工生物工程（上海）股份有限公司；限制性内切酶Xba Ⅰ、EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ、T4 DNA连接酶、南美胎牛血清、细胞胰酶消化液（含酚红）和Lipo 6000TM转染试剂购自碧云天生物技术有限公司；质粒提取试剂盒购自康宁生命科学（吴江）有限公司.

1.2引物设计

从美国国家生物技术信息中心（National center for biotechnology information, NCBI）网站下载PCV2全基因组序列并对序列进行同源分析,利用Primer Premier 5.0软件设计一对用于检测PCV2的特异引物,以及一对扩增基因组全长的引物,并引入Xba Ⅰ酶切位点,以利于下游基因操作,本研究所用引物如表1所示.

1.CV2株全基因组克隆

以用常规方法提取感染病毒细胞总DNA为模板,利用PCV2特异性引物TF1094和TR1471进行PCR.PCR反应首先在 94 ℃进行预变性5.0 min；接着进行30个循环的94 ℃变性30 s,56 ℃退火30 s,72 ℃延伸30 s,72 ℃延伸5.0 min.反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.以上述总DNA为模板,利用GF1358和GR1363引物对进行PCV2全基因组克隆.除PCR扩增延伸时间延长至1.5 min外其它反应参数同上.将PCR产物回收后与pMD18T克隆载体连接,转化大肠杆菌DH5α,经挑取单菌落,提取并将酶切鉴定的质粒进行测序.

1.4pSKPCV2重组质粒构建

将测序正确的pMDPCV2质粒用Xba Ⅰ酶切,凝胶电泳分离PCV2片段,把回收的 PCV2 DNA与pSK质粒用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜.将连接产物直接转化大肠杆菌DH5α,挑取单菌落,提取质粒送公司测序.

1.5病毒双链裸DNA制备及转染

提取质粒并用Xba Ⅰ内切酶做酶切鉴定,将切下的目的片段用T4 DNA连接酶自环化,获得病毒双链环化DNA.按照Lipofecter脂质体转染试剂盒说明书,将鉴定正确的环化重组质粒转染PK15细胞,并在37℃、5% CO2条件下培养48 h,反复冻融3次后收集上清液,接种于新培养的 PK15细胞并连传15代.

1.6病毒体外转录鉴定

根据RNAiso TM Plus说明书提取总RNA,并用DNase Ⅰ处理,以除去混有RNA的少量病毒DNA,以纯化后的RNA为模板,利用MMLV逆转录酶逆转录合成cDNA,再用引物对CapR466和GF1358进行PCR.除循环次数增加到35个外,其它扩增条件同1.3.用10 g/L的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物.

1.7间接免疫荧光检测

将传代培养15代的接毒细胞消化分装于6孔板,每孔注入3.0×105个细胞,在CO2培养箱中培养48 h后用PBS缓冲液洗涤,拍干,通过100%甲醇固定细胞10.0 min,弃去固定液,用PBS清洗两次后以抗PCV2的ORF2兔多抗为一抗,37 ℃作用1 h,FITC标记羊抗兔荧光二抗(11000稀释)为二抗,37 ℃作用1 h,每孔加入1滴磷酸甘油封片液,荧光显微镜观察,以正常PK15细胞作为阴性对照.

2结果与分析

2.1PCV2全基因组克隆及序列分析

以细胞毒总DNA为模板,用PCV2全长引物对GF1358/GR1363扩增到约1.8 kb目的片段,结果如图1所示.将纯化的目的片段克隆到pMD18T获得pMD18PCV2,阳性克隆经过EcoR Ⅰ和

Hind Ⅲ双酶切鉴定结果如图2所示.测序结果显示,本研究获得PCV2毒株基因组全长序列为1767 bp,将该序列与国内外27个代表性PCV2毒株进行序列比较,结果表明同源性在95.4%~99.9%之间,不存在明显特殊变异,与GQ996404的亲缘关系最密切,同源性达99.9%（图3）.

M：DL 2 000 DNA Marker; 1：未接毒PK15细胞总DNA；

2：接毒PK15细胞总DNA

图1PCV2全基因组扩增检测照片

M：1 kb DNA Ladder；1-4：重组质粒EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切

图2重组质粒EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切鉴定照片

2.2pSKPCV2重组质粒构建

质粒pMDPCV2经Xba Ⅰ限制性内切酶37 ℃酶切,回收目的片段,并与pSK载体连接获得重组质粒pSKPCV2,将其再次经Xba Ⅰ限制性内切酶酶切鉴定,产生与预期相符的1767 bp和2961 bp目的片段,结果如图4所示,表明PCV2全基因组成功克隆至载体pSK.

图CV2SY毒株的系统进化关系

M： DNA Marker；1： Xba Ⅰ酶切产物

图4pSKPCV2酶切鉴定照片

2.3病毒自环化及转染

Xba Ⅰ酶切重组质粒并经凝胶电泳鉴定正确后,回收PCV2全基因组酶切产物并用T4 DNA连接酶16 ℃连接过夜,形成自环病毒DNA.重组病毒持续盲传15代,每一代都进行病毒液回收并再次感染新的PK15细胞,再对回收的病毒液提取DNA进行PCR检测.图5为盲传第10代PCR检测结果,自环化重组病毒和野毒均产生378 bp大小目的PCR产物,但pBluescript SKPCV2转染细胞和PK15细胞无阳性产物,表明自环化重组病毒已成功转染并可在PK15细胞内进行稳定复制传代.

M： DNA Marker；1：空白阴性对照；2：野生PCV2；3：重组PCV2；

4：pSKPCV2转染PK15阴性细胞; 5：PK15阴性细胞

图5PCR检测传代10代病毒DNA***

2.4病毒Cap蛋白基因转录检测

提取盲传10代的重组细胞病毒液中总RNA后,经DNase Ⅰ处理,RTPCR扩增后电泳检测条带大小约486 bp,表明转染细胞中Cap基因mRNA存在特异性剪接和表达（图6）.

M：DNA Marker；1：阴性对照；2：未经DNase Ι处理PCV2 RNA；

3：PCV2 DNA；4：DNase Ι处理的PCV2 RNA；

5：PK15阴性细胞RNA

图6重组病毒Cap RNA检测

2.4间接免疫荧光检测

重组病毒感染爬片细胞后48 h利用IFA检测PCV2 ORF2表达,结果如图7所示,重组PCV2感染细胞用抗PCV2 ORF2抗体为一抗在荧光显微镜下检测到特异性绿色荧光,而阴性对照细胞无特异荧光产生,因此自环病毒在体外转染后再感染细胞可以产生具感染性的子代PCV2病毒.

图7重组病毒感染PK15细胞间接免疫荧光检测

3讨论

越来越多的研究表明,PCV2通常以混合感染的方式引起猪只PMWS,因此由PCV2混合感染病料直接接种细胞难以获得纯的PCV2病毒,给PCV2相关研究增加难度［2022］.Meerts等［23］发现,PCV2在接种后6~12 h的PK15细胞内可检测到Cap蛋白表达,接种后12～24 h的Cap主要分布在细胞核周围,并有子代病毒产生.通过细胞连续传代表明PCV2增殖能力较强,因而利用病毒的感染性DNA克隆,获得遗传背景单纯的拯救病毒,是PCV2致病机理、相关疾病防治和疫苗开发研究的有力工具.

国内外已有应用PCV2全基因组复制出完整病毒的报道.Liu等［24］构建含有 PCV2全基因组的重组质粒,体外环化转染猪视网膜细胞系得到具有感染性的病毒,应用构建的感染性病毒在进行致病性实验时可避免其它病毒的干扰,容易定量和在细胞传代过程中不易产生变异等优点.Fenaux等［25］和郗鑫等［26］用酶切位点Sac Ⅱ构建PCV2体外感染性分子克隆,但采用体外自环的方式将PCV2全基因环化再转染PCV阴性PK15细胞,在其子代细胞中检测到病毒相应的抗原,而Fenaux将线性化的两条单拷贝PCV2同向连接在一起,利用酶切位点Sac Ⅱ与pBluescript SK载体连接构成重组质粒后转染PK15细胞,再感染以获得成熟病毒粒子,同时发现双拷贝比单拷贝体外转染细胞效率高.本研究利用高拷贝的质粒载体pMD18T正向插入单拷贝的PCV2全基因,两端引物含Xba Ⅰ序列重叠,经自环化显示构建的自环化质粒dsPCV2具有感染性,但与李俊等［27］研究结果不同,重组质粒pSKPCV2转染PK15细胞没有检测到子代病毒,推测与PCV2的滚环复制机制和共价闭合环状DNA基因组有关［2829］.连到pBluescript SK载体上的PCV2全基因组DNA分子因载体序列的分隔使PCV2全基因组不连续,因而失去部分重要功能.另一种可能原因是由于重组质粒pSKPCV2转染产生子代病毒但在PK15细胞中的增殖滴度不高,基因组转染效率较差,导致转染后细胞PCR检测呈阴性.

4结论

本文通过PCR成功扩增出PCV2 1767bp全基因组,利用设计的一对含Xba Ⅰ酶切位点的特异性引物成功构建PMDPCV2重组质粒.将质粒体外酶切自环化后转染PK15细胞并检测到PCV2病毒的复制,结果表明,本研究成功构建PCV2全长DNA克隆和拯救病毒.经过测序的PCV2SY株系为PCV2b亚型,与国内外毒株有着极高的同源性,介于95.4%~99.9%之间,具有很强的代表性,为后续研究PCV2病毒致病机理、疫苗开发和有效治疗奠定基础.

参考文献：

［1］ 殷震,刘景华.动物病毒学［M］.2版.北京:科学出版社,1997：2730.

［2］ Tischer I, Gelderblom H, Vetteermann W, et al. A very all porcine virus with circular single stranded DNA［J］. Nature,1982,295(7):6466.

［3］ Allan G M and Ellis J A. Porcine circoviruses: A review［J］. Journal of Veterinary Diagnistic Investigation,2000,12(1):314.

［4］ Opriessnig T, Meng X J and Halbur P G. Porcine circovirus type 2 associated disease: Update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies［J］. Journal of Veterinary Diagnistic Investigation,2007,19(6):591615.

［5］ Palinski R, Pineyro P, Shang P, et al. A novel porcine circovirus distantly related to known circoviruses is associated with porcine dermatitis and nephropathy syndrome and reproductive failure［J］. Journal of Virology,2016,91(1):e0187916.

［6］ Allan G, Meehan B, Todd D, et al. Novel porcine circovirus from pigs with wasting disease syndromes［J］. Veterinary Record,1998,142(17):467468.

［7］ Morozov I, Sirinarumitr T, Sorden S, et al. Detection of a novel strain of porcine circovirus in pigs with postweaning multisystemic wasting syndoome［J］. Journal of Clinical Microbiology,1998,36(9):25352541.

［8］ Hamel A, Lin L, Nayar G P. Nucleotied sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrorne in pigs［J］. Journal of Virology,1998,72(6):52625267.

［9］ Allan G M, Ellis J A. Porcine circoviruses: A review［J］. Journal of Veterinary Diagnistic Investigation,2000,12(1):314.

［10］ Segalés J, Allan G M, Domingo M. Porcine circovirus diseases［J］. Animal Health Research Reviews,2005,6(2):119142.

［11］ Cheung A K. Comparative analysis of the transcriptional patterns of pathogenic and nonpathogenic porcine circoviruses［J］. Virology,2003,310(1):4149.

［12］ Mankertz A, Hillenbrand B. Replication of porcine circovirus type 1 requires two proteins encoded by the viral rep gene［J］. Virology,2001,279(2):429438.

［13］ Nawagitgul P, Morozov I, Bolin S R, et al. Open reading frame 2 of porcine circovirus type 2 encodes a major capsid protein［J］. Journal of General Viro1ogy,2000,81(9):22812287.

［14］ Mahé D, Blanchard P, Truong C, et al. Differential recognition of ORF2 protein from type 1 and type 2 porcine circoviruses and identification of immunorelevant epitopes ［J］. Journal of General Virology, 2000,81(7):18151824.

［15］ Liu J, Chen I, Kwang J. Characterization of a previously unidentified viral protein in porcine circovirus type 2infected cells and its role in virusinduced apoptosis［J］. Journal of Virology,2005,79(13):82628274.

［16］ He J, Cao J, Zhou N, et al. Identification and functional analysis of the novel ORF4 protein encoded by porcine circovirus type 2［J］. Journal of Virology,2013,87(3):14201429.

［17］ Gao Z, Dong Q, Jiang Y, et al. ORF4protein deficient PCV2 mutants enhance virusinduced apoptosis and show differential expression of mRNAs in vitro［J］. Virus Research,2014,183(7):5662.

［18］ Lv Q Z, Guo K K, Xu H, et al. Identification of putative ORF5 protein of porcine circovirus type 2 and functional analysis of GFPFused ORF5 protein［J］. PLos One,2015,10:e0127859.

［19］ Li D, Wang J, Xu S, et al. Identification and functional analysis of the novel ORF6 protein of porcine circovirus type 2 in vitro［J］. Vetetinary Researh Communications,2018,42(1):110.

［20］ Opriessnig T, Meng X J, Halbur P G. Porcine circovirus type 2associated disease: Update on current terminology, clinical manifestations, pathogenesis, diagnosis, and intervention strategies［J］. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation,2007,19(6):591615.

［21］ 郭龙军,陆月华,黄立平,等.猪圆环病毒2型不同基因型毒株感染性克隆的构建及拯救毒株的体外生物学特性［J］.中国农业科学,2011,44(23):49184925.

［22］ 杨顺利,尹双辉,沈小燕,等.猪圆环病毒2型感染性DNA的构建及病毒拯救［J］.中国兽医学报,2011,31(2):169173.

［23］ Meerts P, Misinzo G, McNeilly F, et al. Replication kinetics of different porcine circovirus 2 strains in PK15 cells［J］. Archives of Virology,2005,150(3):427441.

［24］ Liu Q, Wang L, Willson P, Babiuk L A. Quantitative competitive PCR analysis of porcine circovirus DNA in serum from pigs with posteaning multisystemic wasting syndrome［J］. Journal of Clinical Microbiology,2000,38(9):34743477.

［25］ Fenaux M, Halbur P G, Haqshenas G, et al. Cloned genomic DNA of type 2 porcine circovirus is infectious when injected directly into the liver and lymph nodes of pigs: Characterization of clinical disease, virus distribution, and pathologic lesions［J］. Journal of Virology,2002,76(2):541551.

［26］ 郗鑫,陈焕春,陈华平,等.猪Ⅱ型圆环病毒全基因组的克隆及感染性鉴定［J］.微生物学报,2004,44(2):172176.

［27］ 李俊,时建立,于周,等.猪圆环病毒2型双拷贝感染性DNA的构建及体外拯救［J］.生物工程学报,2009,25(11):16331638.

［28］ Hamel A L, Lin L L, Nayar G P. Nucleotide sequence of porcine circovirus associated with postweaning multisystemic wasting syndrome in pigs［J］. Journal of Virology,1998,72(6):52625267.

［29］ Cheung A K. Rollingcircle replication of an animal circovirus genome in a thetareplicating bacterial plaid in Escherichia coli［J］. Journal of Virology,2006,80(17):86868694.

病毒论文范文结:

关于病毒方面的论文题目、论文提纲、病毒论文开题报告、文献综述、参考文献的相关大学硕士和本科毕业论文。