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HPC法测定保健食品中四种大豆异黄酮的含量
摘 要：为建立HPLC法测定保健食品中四种大豆异黄酮的含量,采用Phenomenex Syneisi Fusion-RP80 (4 bt,m,4.6×150 mm)色谱柱,柱温30℃,以乙腈一水(pH值为3.0)梯度洗脱.流速1.0 mL/min,检测波长260 nm.结果显示,4种大豆异黄酮的标准曲线线性良好(r> 0.999 9,n等于7),大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素平均回收率分别为101.61%、100.11%、101.95%、101.2%.可见本方法简便、灵敏、有效,可为该类保健食品含量测定及质量控制提供依据.
关键词：HPLC法：保健食品：大豆异黄酮
大豆异黄酮是一类具有营养学价值和治疗意义的非固醇类物质,其具有与雌激素类似的分子结构,同时,也是一种植物多酚,具有较强的抗氧化作用,也是目前国际上公认的安全有效的天然植物雌激素.目前,该类食品的检验标准专属性不强,为有效控制该类食品的质量,建立HPLC法测定保健食品中四种大豆异黄酮的含量,为有效控制产品的质量提供依据.
1仪器与试药
Shimadzu LC20A高效液相色谱仪：四元低压梯度泵,LCsolution数据系统,SPD-20A检测器.四种大豆异黄酮对照品：大豆苷(批号：111738-200501)、染料木苷(批号：111709-200501)、大豆素(批号：100347-200702)、染料木素(批号：111704-200501),均由中国食品药品检定研究院提供.样品：为市场抽验样品.试剂,乙腈(HPLC),甲醇(AR),醋酸(AR),水为娃哈哈纯净水.
2方法与结果
2.1溶液制备
对照品贮备溶液及对照品溶液的制备：精密称取对照品适量,分置50 mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释至刻度,摇匀,作为对照品贮备溶液1（大豆苷）、2（染料木苷）、3（大豆素）、4（染料木素）.精密量取对照品贮备溶液l、2各10 mL,对照品贮备溶液3、4各ImL,同置25 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为标准溶液1,另精密量取2 mL标准溶液1,置10 mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,作为标准溶液II.
2.2方法学考察
线性关系考察：精密吸取20、10、5 μL标准溶液l与10、5、2、lμL标准溶液II,分别注入HPLC仪,测定峰面积,以进样量(μg)为横坐标,峰面积为纵坐标,绘制标准曲线,结果表明大豆苷在0.030 672～1.536 66 μg.染料木苷在0.03168～3.168μg.大豆素在0.003 4512～0.345 12 μg.染料木素在0.003 56～0.356 μg的范围内均呈良好的线性关系.
精密度试验：精密吸取标准溶液1 5μL,连续重复进样6次,分别测定大豆苷、染料木苷、大豆素、染料木素峰面积.结果RSD分别为0.64%,0.65%,0.62%,0.62%(n等于6), 表明仪器精密度良好.
加样回收率试验：取6只具塞锥形瓶,各精密量取对照品贮备溶液1（大豆苷）、2（染料木苷）各5mL,对照品贮备溶液3（大豆素）、4（染料木）各ImL,挥尽溶液,精密称取已知含量（每lg含大豆苷18.682 mg,含染料木苷24.988 mg,含大豆素0.308 mg,含染料木素0575 mg)的同一批样品6份,分置上述具塞锥形瓶中,照拟订方法制备供试品溶液并按拟订色谱条件测定,计算回收率.大豆苷、大豆素、染料木苷、染料木素平均回收率分别为101.61%、100.11%. 101.95%. 101.21%.
3讨论
提取溶液的确定：本实验用甲醇、80%甲醇、50%甲醇三种溶液分别按样品处理方法提取同一样品,计算峰面积与取样量的比值,结果表明三种溶液的提取效果差异显著,以甲醇提取效果最佳,50%甲醇提取效果次之,80%甲醇提取效果最差.依据实验结果,选择甲醇为溶解样品的溶液.
超声提取时间的确定：本实验用甲醇按样品处理方法,分别超声处理20、30、40 min,提取同一样品,计算峰面积与取样量的比值,结果表明超声处理30 min与40 min,提取效果无差异,而与超声处理20 min提取效果差异显著.依据实验结果,选择以超声处理30 min为本实验的提取时间.
方法耐受性考察：本实验考察了Shimadzu LC20A高效液相色谱仪与Agilentll00型液相色谱仪分别搭配Synersi Fusion-RP 80(4μm,4.6×150mm)色谱柱与Waters Symmetry@-C18(5 μm,4.6×150 mm)色谱柱,在本实验条件下分别测定同一样品的情况,色谱柱不同样品保留行为有差异,但测定结果一致.
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